绿茶粉改善免疫应激小鼠肠道屏障的作用机制

为探究绿茶粉改善免疫应激小鼠肠道屏障功能的作用机制。选取72只三周龄SPF级C57BL/6雄鼠,对其适应性喂养3 d后随机分成Ⅰ组(阴性对照)、Ⅱ组(阳性对照)、Ⅲ组(添加抗生素)、Ⅳ组(添加1%绿茶粉+茶多酚)、Ⅴ组(添加2%绿茶粉+茶多酚)和Ⅵ组(添加3%绿茶粉+茶多酚),每组3个重复,每个重复4只。在小鼠45 d时,Ⅰ组腹腔注射生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组按10μL/g的剂量腹腔注射大肠杆菌脂多糖。注射5 h后采集血液及组织器官。采用RT-PCR测定肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量; ELISA法测定血清中IgA、IgG、IgM、肠道sIgA和血浆内毒素含量。结果表明,与Ⅱ组相比,添加茶多酚的绿茶粉能显著降低小鼠血浆内毒素的含量,促进血清中IgA、IgG、IgM和肠道sIgA分泌,同时增加肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量。本研究表明,绿茶粉可以通过促进肠上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin蛋白相对表达量,修复肠道屏障,增强免疫应激小鼠的体液免疫,从而减轻肠道炎症,达到保护肠道的作用。     

一株J亚型禽白血病病毒的分离鉴定及其gp85基因的序列分析

为确定安徽巢湖某地方品种养鸡场的疑似禽白血病(avian leukosis,AL)的病原,以DF-1细胞从肿瘤组织中分离病毒,采用RT-PCR方法进行鉴定,并对其感染细胞上清进行透射电镜观察。同时对送检病鸡的心、肝、脾及腺胃等进行组织病理学观察,最后将扩增出的gp85基因与GenBank收录的其他ALV序列进行比对分析。结果表明:PCR扩增产物大小约为928 bp,经测序证实为ALV gp85基因,将该分离株命名为AHCH-2018株。透射电镜观察到具有囊膜的大小约100 nm的病毒粒子。组织病理学结果显示,病鸡的心、肝、脾及腺胃中有大量成灶淋巴细胞增殖。遗传进化分析结果表明,分离株的gp85基因与多株ALV J参考毒株核苷酸序列的同源性为94.1%~99.5%,且与GD1401J株的核苷酸同源性最高,达99.5%,与A、B、C、D、E亚群同源性为46.5%~49.7%。该分离株与J亚群原型毒株处于同一大分支。本研究为了解安徽土鸡种群中禽白血病的分子流行病学特点提供了一定的数据参考。     

大豆抗原蛋白对仔猪的免疫作用

通过口服或注射两种免疫途径研究大豆抗原蛋白免疫剂对仔猪血清中大豆抗原蛋白抗体效价及IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平的影响。选取70头7日龄“杜×长×大”杂交仔猪,随机分成A组(对照)、B组[β-伴大豆球蛋白(7S)致敏]、C组[大豆球蛋白(11S)致敏]、D组(7S口服免疫+致敏)、E组(11S口服免疫+致敏)、F组(7S注射免疫+致敏)和G组(11S注射免疫+致敏),每组10头。D、F组和E、G组仔猪在7日龄时按分组设计,口服或注射纯化的11S或7S免疫剂,A组注射生理盐水;在14日龄时再免疫一次。所有仔猪于21日龄断奶。从21日龄开始,A组仔猪饲喂基础日粮,B、D、F组和C、E、G组仔猪饲喂分别添加5% 7S或5% 11S的基础日粮,连续饲喂7 d。在27日龄时,对仔猪进行皮肤致敏试验。在 7、14、21、27日龄时,所有仔猪前腔静脉采血,采用ELISA法检测血清中IgA、IgM、IgE、IgG和IL-4水平,采用琼脂扩散法测定血清中7S和11S的抗体效价。结果显示,仔猪皮肤致敏评判结果B、C组>D、E组>A、F、G组,且7S致敏性高于11S。在21日龄时,F、G组血清中抗体效价高于D、E组;在27日龄时,B、C组血清中抗体效价高于D、E、F、G组。在14日龄时,F组与A组相比,IgG、IL-4水平显著(P<0.05)升高;在21日龄时,D、E、F、G组的IgM、IgE、IgG、IL-4水平与A、B、C组相比显著(P<0.05)升高,除了G组IgG外,F、G组又显著(P<0.05)高于D、E组;在27日龄时,各处理组IgE、IgG和IL-4水平极显著(P<0.01)高于A组,且B组显著(P<0.05)高于C组,D、E组显著(P<0.05)高于F、G组。试验结果证实,7S对仔猪的致敏作用高于11S,大豆抗原蛋白免疫剂对仔猪具有一定的免疫保护作用,且对7S的免疫效果优于11S,注射免疫的效果要优于相同剂量的口服免疫。     

羊口疮病毒F1 L融合Fe蛋白的表达与鉴定

本研究克隆了羊口疮病毒安徽分离株的F1L基因,融合Fe蛋白编码基因后,插入载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-F1L-Fe。将pET-F1L-Fe转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达重组蛋白F1L-Fe。SDS-PAGE分析结果显示,羊口疮病毒F1L-Fe基因在BL21(DE3)获得了正确表达。将大量表达的F1L-Fe蛋白进行纯化,然后免疫BALB/c鼠,制备了抗F1L蛋白的多克隆抗体。最后,以制备的多克隆抗体对F1L-Fe融合蛋白进行Western-blot检测和分析,结果表明F1L-Fe蛋白能与制备的多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。本研究结果为进一步研发羊口疮病毒亚单位疫苗提供了物质基础。     

1株番鸭源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力基因分析

为查清引起滁州地区某养殖场雏番鸭死亡原因,本研究通过对分离细菌的鉴定和动物致病性试验,确定奇异变形杆菌是引起此次雏番鸭发病的病原体,并将分离的奇异变形杆菌命名为AHcz-1株.根据其16S rRNA基因序列,建立其遗传进化树;根据已报道的8个毒力基因ureC、zapA、mrpA、ucaA、rsbA、pmfA、atfA、atfC序列,设计引物进行PCR扩增,并对毒力基因进行序列分析.结果显示:AHcz-1株与日本株(AB932526.1)亲缘关系最近,同源性高达100%;毒力基因pmfA、atfA、ureC均未发生变异;AHcz-1株具有较强的致病性;致病菌对丁胺卡那高度敏感,对庆大霉素、恩诺沙星中度敏感,对其它17种抗生素不敏感,表明AHcz-1株具有多重耐药性.本研究为番鸭源奇异变形杆菌临床诊断、临床用药及遗传变异研究奠定了基础.     

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒(PPRV)中扩增出C基因。将C基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建出重组表达质粒pGEX-6P-1-PPRV-C。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞后,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达出的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定正确后,免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果表明:C蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体的形式表达,分子量大小约为42ku;Western-blot结果表明重组C蛋白具有良好的反应原性;琼脂扩散试验结果表明制备的抗C蛋白多抗血清效价为1∶2。这一研究成功克隆出C基因,制备出多克隆抗体血清,为今后进一步深入研究C蛋白的功能提供了生物材料。     

稳定表达小反刍兽疫病毒受体Nectin-4的MDBK细胞系的建立

小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)是小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)的病原。Nectin-4为PPRV感染宿主上皮细胞的受体。本研究采用合成的Nectin-4基因,构建重组质粒pLOV-eGFP-Nectin-4。将该重组质粒与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。为了构建稳定表达PPRV受体Nectin-4的MDBK (Madin-Darby bovine kidney)细胞系,将含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDBK细胞,利用嘌呤霉素筛选、纯化,获得了稳定表达Nectin-4蛋白的MDBK细胞,将其命名为MDBK-Nectin-4。pLOV-eGFP-Nectin-4、p SPAX2和pMD2.G三质粒共转染293T细胞后荧光结果表明,慢病毒成功包装。嘌呤霉素对MDBK细胞最小致死浓度检测结果表明,1μg/mL的嘌呤霉素为最佳的筛选工作浓度。RT-PCR检测结果表明,Nectin-4基因能够在MDBK-Nectin-4细胞中转录成mRNA。Western blot检测结果表明,Nectin-4在MDBK-Nectin-4细胞中能够稳定表达。间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)结果表明,表达的Nectin-4蛋白主要分布在细胞膜上。构建的MDBK-Nectin-4细胞系在连续传代至20代,仍然能够稳定表达Nectin-4蛋白,结果表明具有良好的遗传稳定性。PPRV分别感染MDBK细胞与MDBK-Nectin-4细胞系,后者较于前者能够更快地出现细胞病变。该细胞系的建立为深入研究PPRV与受体Nectin-4的相互作用机制,以及临床快速地分离PPRV提供了实验材料。     

羊口疮病毒127基因的克隆表达及亚细胞定位分析

为了对羊口疮病毒(ORFV) AH-F10株127基因进行原核表达及亚细胞定位,本试验采用PCR方法扩增出ORFV127基因,成功构建原核表达重组质粒pG EX-6p-1-ORFV127和真核重组质粒pE GFP-N1-ORFV127。将原核表达重组质粒转化到大肠埃希氏菌中表达,并进行纯化和鉴定。以纯化的蛋白质免疫BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,利用Western-blot技术鉴定其反应原性。利用脂质体介导法将重组质粒pE GFP-N1-ORFV127转染至Vero细胞,通过倒置荧光显微镜观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果表明,获得的ORFV127基因序列全长为558bp,ORFV127蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,主要以包涵体蛋白质的形式表达,大小约49 000。Western-blot结果显示,免疫小鼠获得的抗ORFV127蛋白的多克隆抗体可特异性识别ORFV127蛋白,倒置荧光显微镜观察发现,ORFV127蛋白主要定位于细胞质。本试验结果为后续研究ORFV127蛋白的功能提供了宝贵的生物材料。     

猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

为了解猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况,对新分离的FIPV AH1905株的N基因进行了克隆和序列比对分析,并利用生物信息学软件对N基因编码蛋白的二级结构进行了预测。最后,将N基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在原核细胞中进行表达,并制备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPV AH1905株的N基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸。序列比对分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷酸同源性为90.2%~92.4%,氨基酸同源性为91.8%~93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支,同属于FIPV基因Ⅰ型。对N蛋白二级结构预测结果显示,该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点,含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位和2个Th表位。Western blot检测结果证明,N蛋白在大肠埃希菌细胞中主要以包涵体形式大量表达,相对分子质量约为68 ku,具有良好的反应原性。以上结果可为进一步开展FIPV的流行病学和分子生物学研究奠定基础。     

肉鸡群发生败血霉形体病的诊治

肉鸡群发生败血霉形体病的诊治某肉鸡专业户于１９９５年８月从山海关购进艾维茵雏鸡１２００只，由于饲养管理得当至２５日龄雏鸡生长良好。后来因出现连续雾雨天气，温度下降幅度较大，饲养员为了保温而没有注意通风换气，鸡群出现咳嗽、打喷嚏、气喘等呼吸道症状。在使...