猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因原核表达条件的优化及蛋白纯化

为了提高新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因在大肠杆菌中的表达量,研究了温度、诱导时间以及诱导剂（IPTG）浓度等不同条件对TamsⅠ融合蛋白表达量的影响。试验结果表明,大肠杆菌菌株BL21（DE3）在37℃培养2．5h后,使用终浓度为2mmol／L的IPTG在25℃振荡诱导培养8h时,GST—TamsⅠ融合蛋白表达量最高,达到2．5rmg／mL。用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST—TamsⅠ融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE检测表明GST-TamsⅠ融合蛋白大小约为56kl）,与预计的分子量大小一致。TamsⅠ基因的优化表达为牛环形泰勒虫病的分子免疫学诊断和哑单位疫苗的研制奠定了基础。     

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

油松苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建及表达分析

利用基因重组技术,以油松PAL基因(TaPAL) CDS区(2 157 bp)作为外源基因的同源重组片段,构建了pET-28a-TaPAL重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达并进行分析.经SDS-PAGE电泳检测,在分子量80 KD处获得一条特异蛋白的表达条带,且其大小与预期相符.在温度28℃,IPTG浓度1.5 mmol· L-1,时间3h条件下,重组质粒的表达量最大.可溶性分析表明,在最佳诱导条件下,该蛋白主要以包涵体形式存在.粗酶活性测定表明,粗酶(在20℃、IPTG浓度1 mm01·L-1条件下诱导10 h)比活力为55.3μmol·min-1·gpro-1,即55.3U·g-1.构建的pET-28a-TaPAL重组载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出具有生物活性的融合蛋白.     

水稻白叶枯病菌HrpF_(Xoo)与GFP的体外融合表达

从水稻白叶枯病菌中克隆hrpF基因,hrpF与gfp(Green fluorescent protein)基因融合,连接pET30a( )载体,构建重组质粒pET30a( )::hrpFXoo::gfp,转化宿主菌BL21 (DE3) 产生表达菌株pOFG.表达菌株经IPTG诱导培养,获得了HrpF的GFP融合蛋白.收集菌体通过超声波破碎后,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,可见116 300 大小的组氨酸标记的HrpF与GFP的融合蛋白条带,与分析软件推测大小一致.该研究结果将促进HrpF蛋白功能研究.     

重组α-银环蛇毒素融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化(英文)

[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。     

海州香薷金属硫蛋白(EhMT1)的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致.对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系.诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70 mg.用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清可以特异性结合.     

白菜BcMF2基因在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR方法扩增BcMF2cDNA完整的编码区序列,构建pETBcMF2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达;SDSPAGE电泳检测发现在70kD处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IPTG终浓度为0.4～1.0mmol·L-1时诱导6h,均能获得较高的表达量。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

猪血管紧张素转化酶2重组蛋白诱导表达和纯化条件的优化

[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。     

大肠杆菌异质型ACCase亚基基因accB重组表达载体的构建和原核表达

摘要：克隆大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA Carboxylase, ACCase）的生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21（DE3）工程菌株, IPTG诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43KDa。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因在大肠杆菌中表达条件优化

[目的]为提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coli BL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和Gene Tools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH 7.0,装液量20%,振荡速度200 r/min;最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6 h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达70.98 mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。     

鸡VEGF基因的克隆及融合蛋白的表达与分离纯化

为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体.随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定.将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF.GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的蛋白.Western blot分析证实,纯化后蛋白是GST-cVEGF融合蛋白,为进一步研究CST-cVEGF融合蛋白疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础.     

猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性E2蛋白。对IPTG浓度及诱导温度和时间进行优化,结果显示,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,18℃条件下诱导表达16 h,E2蛋白的可溶性表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白,其终质量浓度为0.5 g/L。Western blot分析和间接ELISA结果显示,纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下都能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2蛋白活性良好。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行病毒中和试验,结果显示,免疫后56 d产生较高水平的中和抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。综上,成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白,且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。