低磷胁迫下对转AtGAPC2基因马铃薯株系的评价与筛选

【目的】研究转AtGAPC2基因马铃薯试管苗对低磷胁迫的响应,评价并筛选耐低磷优良株系。【方法】以26个转AtGAPC2基因马铃薯株系及其非转基因对照品种"川芋10号"的试管苗为材料,在组培体系下设置正常磷(1.25×10-3 mol/L)与低磷(1.25×10-5 mol/L)两个水平,测定相关指标。【结果】结果表明:低磷胁迫下,相比于"川芋10号",转AtGAPC2基因株系株型正常,部分表现出地上部生长势旺、根系发达、试管薯产量高等特征,转基因株系间在形态学方面亦存在差异;运用模糊隶属函数法将所有株系划分为4个级别,96.15%转AtGAPC2基因株系的隶属函数平均值高于"川芋10号",其中以第一级别中L13、L1、L3、L18、L19这5个株系表现最好;合单株块茎产量的综合值,最终筛选出L13、L1、L3这3个株系,其单株块茎产量综合值分别是56.2%、93.0%、83.1%,显著高于"川芋10号"的26.1%。【结论】转AtGAPC2基因能提高马铃薯试管苗对低磷胁迫的耐受性。     

转TaLEA基因小黑杨抗寒株系的筛选

为验证转TaLEA基因小黑杨耐低温能力并筛选抗寒的优良株系,对11个转LEA基因小黑杨株系与非转基因野生型小黑杨对照(WT)进行了低温胁迫处理,测定其丙二醛(MDA)的质量摩尔浓度、过氧化物酶( POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、叶绿素质量分数、冷害指数等.结果表明:低温胁迫条件下,除XL09外,其余各转基因株系...     

耐碱转GsGSTs基因苜蓿的农艺性状调查

为研究前期获得的耐碱转GsGSTs基因苜蓿与其对照在农艺性状上是否存在差异,进行了产量性状和形态性状的调查与统计分析.产量性状包括鲜草产量、干物质产量及茎分枝数;形态性状包括株高增长速度、节数及节间长度,同时进行了碱胁迫下表型分析.结果表明,转GsGSTs基因苜蓿植株在产量性状及形态性状方面与对照相比无显著差异.在碱胁迫下,非转基因苜蓿对照株系明显萎蔫、失绿,而转GsGSTs基因苜蓿株系均能保持较正常的生长状态.此结果说明外源基因GsGSTs在苜蓿中的表达没有改变其本身优良的农艺性状,同时其目标性状(耐碱性)有所提高,符合转基因植物安全评价中“实质等同”原则.     

异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

转甜菜碱醛脱氢酶基因玉米的田间筛选及生理分析

为了对已获得的转甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)玉米3个株系的后代进行田间耐盐性鉴定,采用稀释1倍的人工海水在温室内模拟田间盐胁迫进行处理,结果表明:在盐胁迫条件下,转BADH基因玉米成活率较对照高,转基因株系的叶片电导率极显著地低于对照,而叶绿素含量极显著地高于对照。转基因株系后代的耐盐性与对照材料相比具有明显的优势,验证了在田间盐胁迫条件下,BADH基因在转基因玉米后代中的表达,同时也为培育转BADH基因玉米纯系奠定基础。     

天山雪莲SikFBP1基因的抗寒性研究

在植物体内,FBPase酶是卡尔文循环内一个不可缺少的酶,在干旱、高温、盐碱等非生物胁迫中FBPase同样起着重要的作用。本试验从典型的耐极端低温的植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.ER Kir.)中克隆了一段FBPase序列,命名为SikFBP1,同时也克隆出了一段SBPase序列命名为SikSBP。实时荧光定量显示2个基因对寒冷胁迫都做出了响应,为验证其抗寒性功能分别转入了烟草中。通过RT-PCR验证获得转化植株,低温胁迫下,通过丙二醛(MDA)含量、相对电子渗透率(REL)、过超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)及光合效率(Pn)的测量,发现转SikFBP1基因株系与转SikSBP基因株系在光合效率上提高较为微弱,但在耐寒性方面得到了一定的提高,为FBPase的功能研究提供一定参考。     

一个水稻生物产量突变体的遗传分析

[目的]对1个水稻生物产量突变体进行遗传分析。[方法]对转Bar基因水稻后代的筛选和鉴定的过程中,在T1代群体10个株系中发现1个生物产量突变株系;采用除草剂Basta喷洒及PCR扩增等方法对该株系进行遗传分析并进行农艺性状考察。[结果]该基因突变除了使株型增高外,径秆也较粗,开花较早,分蘖多,穗大,生物产量高。该株系分离比率为3∶1,符合孟德尔遗传分离规律。PCR分子检测证实,突变性状与T-DNA插入的目的基因(Bar)没有共分离,表明突变体不是由目的基因的T-DNA插入所引起的。[结论]该研究有助于克隆该突变体诱发基因及理解其对生物产量影响机制。     

山新杨转eIF1A基因及耐盐性分析

将从柽柳cDNA文库中分离的eIF1A基因采用农杆菌介导法进行山新杨的遗传转化。经PCR及Northern检测,证明了该基因已经整合到山新杨基因组中,并且能够在转录水平上得到表达。盐胁迫处理表明:盐胁迫处理7 d后,转基因山新杨净光合速率(Pn)、气孔导度平均值(Gs)分别为对照的1.33、1.27倍。光化学猝灭系数(qp)、PSⅡ电子传递量子产率(ΦPSⅡ)的平均值是对照株系的1.49、1.10倍。胁迫处理15 d后,转基因株系与非转基因株系相比,所受的盐害较小,而高生长均高于对照株系,其平均值是对照的1.26倍。这些指标的变化均证实eIF1A基因的表达能够提高转基因山新杨抵抗盐胁迫的能力。     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

转rd29A基因国槐试管苗对盐胁迫的生理响应

以转rd29A基因国槐株系及其受体亲本植株为材料,在NaCl胁迫下,分别在处理后不同时间测定了耐盐生理指标.结果表明:在0.6%NaCl胁迫下,国槐植株内可溶性糖含量、脯氨酸含量,丙二醛(MDA)含量以及相对电导率都随NaCl胁迫时间的延长而增加;与受体亲本植株材料相比,转基因株系的可溶性糖和细胞膜稳定提高,丙二醛、脯氨酸含量降低.说明转rd29A基因的国槐植株耐盐性得到提高.     

干旱胁迫对分蘖期转基因水稻抗旱性生理生化指标的影响

[目的]通过比较野生型日本晴株系水稻WT和OsCAS基因过表达株系水稻777在分蘖期的抗旱性生理生化指标,分析OsCAS基因高表达株系水稻的抗旱能力。[方法]用10%和15%的PEG模拟干旱胁迫,测定2种株系水稻的CAT、POD和SOD活性及MDA和Pro含量。[结果]在10%PEG处理下,WT和777的3种保护酶活性均有增加;在15%PEG处理下,WT的3种保护酶活性明显降低,777的3种保护酶却能够保持相对较高的活性;此外,WT和777的MDA和Pro含量都随干旱胁迫程度的加深而增加,在同一胁迫条件下WT的MDA和Pro含量要明显高于777的。[结论]OsCAS基因高表达株系777在分蘖期较WT对干旱有较强的抗性,特别是在严重干旱胁迫(15%PEG)时优势尤为明显。     

NaHCO3胁迫对转TaLEA基因山新杨生长及光合、叶绿素荧光特性的影响

为了筛选耐苏打盐渍土的转基因杨树优良株系, 以苏打盐渍土的主要成分NaHCO₃胁迫处理转TaLEA基因的山新杨各株系与对照(NT),测定不同株系的苗高和地径等生长性状,测定净光合速率(P_n)、胞间CO₂浓度(C_i)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)等光合参数以及最大光化学效率(F_v/F_m)、光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(NPQ)、实际光化学电子产量(Φ_PSII)等叶绿素荧光动力学参数,利用染色法分别比较各株系的超氧离子和过氧化氢的累积情况,进而综合评价不同株系对NaHCO₃胁迫的响应。结果表明,NaHCO₃胁迫处理前、后各株系的苗高和地径生长量发生明显分化,由处理前的差异不显著,到处理20 d后的显著,转基因株系的苗高、地径普遍较对照高,表现突出的是转基因株系SL2号,其平均苗高和地径分别较对照提高了17.4%、15.7%;对照的盐害指数是转基因株系的3.3倍,并且转基因株系的平均存活率是对照的2.8倍。各转基因株系的光合参数和荧光参数也较对照增强,P_n、T_r在胁迫20 d后转基因株系较对照分别高了237.38%、649.02%,G_s、C_i在胁迫15 d时转基因株系较对照分别高了119.05%、24.56%,其中SL2号转基因株系较对照分别提高150%、25.81%。各转基因株系的F_v/F_m平均为0.68,对照只有0.45,前者的qP和Φ_PSII只略高于后者,后者的NPQ却是前者的6倍。转基因株系的超氧离子和过氧化氢累积量均少于对照。在相同的碱胁迫环境下,转基因山新杨,尤其是SL2,能保持较快的生长量、较强的光合能力和较低的ROS水平,初步选择其为耐苏打盐渍土的杨树转基因优良株系。      

利用分子标记改良水稻白叶枯病抗性的研究

利用分子标记技术对转抗白叶枯病基因 (Xa2 1)的明恢 63和 80 4B后代进行跟踪筛选 ,得到了纯合稳定株系。同时对转基因恢复系明恢 63进行配组试验 ,对转基因 80 4B纯合稳定系进行不育系的转育 ,并对其配组和转育后代进行PCR分析和人工接菌 ,结果表明Xa2 1基因能稳定遗传表达 ,并出现了一些既抗白叶枯病又有增产潜力的组合     

转OsEBP-89基因水稻芽期与幼苗期的抗盐性鉴定

以100 mmol浓度NaCl盐胁迫,对转OsEBP-89基因水稻T6代3个株系芽期与幼苗期抗盐性进行了鉴定。结果表明,转OsEBP-89基因株系之间抗盐性存在差异,其中两个转基因株系(3448和3463)发芽势比对照日本晴高,芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴,说明转基因材料在100 mmol NaCl胁迫下其芽受到盐的伤害少于对照材料;但其发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。     

StP5CS基因过表达增强高温胁迫下菜用大豆结瘤固氮的能力

高温胁迫严重影响菜用大豆的结瘤固氮过程,增强高温胁迫下菜用大豆结瘤固氮的能力对提高菜用大豆产量具有重要意义。采用蛭石栽培的方法,以转StP5CS基因菜用大豆(T6)为试验材料,研究在35℃高温胁迫下StP5CS基因过表达对菜用大豆结瘤固氮的影响。结果显示:转基因株系的株高、干鲜重及根瘤数目、根瘤干鲜重、单株荚数、粒数、种子重均显著高于非转基因株系(WT);转基因株系根瘤中脯氨酸、豆血红蛋白含量及谷氨酰胺合成酶活性均显著高于WT;经qRT-PCR分析,5个结瘤固氮关键基因(GmENOD40-1,GmENOD40-2,GmGS1β1,GmGS1β2及GmLba)在转基因株系中的相对表达量均显著高于WT。结果表明,高温胁迫下StP5CS基因过表达,促进了脯氨酸的积累,显著增强了菜用大豆的耐热性和结瘤固氮能力,进而提高了菜用大豆的产量。     

PCR标记对水稻温敏雄性核不育株的鉴别

用3个与水稻温敏雄性核不育(TGMS)基因紧密连锁的PCR标记C365-1、S2-40和In Del37,对云南低海拔(260 m)早季种植的2个籼稻TGMS株系配制的杂交组合的F2和F3代分离群体中筛选出的146个单株(126个TGMS单株和20个可育株)及经多代自交获得的15个TGMS株系的基因型进行鉴别,结果表明:只有标记C365-1在来自两个群体的不育株和可育株DNA池间显示出多态性。不育株DNA池产生两个PCR片段,分别为418 bp(定名为C365-418 bp)和344 bp(定名为C365-344 bp),而可育株DNA池只产生C365-418 bp片段。经克隆测序比对,显示多态性的C365-344 bp片段与水稻第2染色体上的OJ1001_D05克隆的DNA序列相似性为84%,与TGMS基因ptgms2-1和tms5的距离约为19.1 kb;与水稻第6染色体上的OJ1001_B06.3和OJ1001_B06.4两个克隆间隔区的DNA序列的相似性为98%,与TGMS基因TMS相距约1 c M。在146个单株中,标记C365-1的基因型值与单株育性表型值间的相关系数为0.944,达极显著水平。来自15个TGMS株系的每一个株系都显示出与不育株DNA池相同的带型。以上结果说明,PCR标记C365-1可较为有效地鉴别水稻TGMS株携带的TGMS基因,该标记可作为水稻TGMS株基因型分子标记辅助选择的有效标记。     

根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生

含双元载体pBEWMV的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)　LBA4404感染甜瓜（Cucumis melo）子叶外植体,获得了可育的转基因甜瓜植株。该质粒载体内含选择标记基因npt-Ⅱ（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）和WMV-Ⅰ CP基因（西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因）。NPT-Ⅱ酶活性检测、DNA分子点杂交、PCR检测及Southern杂交试验表明,外源的WMV-1 CP基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。     

菊花CmDREBa-2基因的功能验证

为探究CmDREBa-2基因的抗性功能,了解CmDREBa-2调控菊花参与高、低温防御反应及响应白色锈病的分子机制,构建了过表达载体pBI121-CmDREBa-2,利用农杆菌介导法转化菊花'C029'。对转基因植株进行45℃高温、-4℃低温及接菌处理后,观察表型并分析下游基因表达量。结果表明:PCR检测共获得2个阳性植株,半定量与qRT-PCR表明CmDREBa-2成功高表达。在45℃的高温胁迫处理下,转基因株系存活率显著高于野生型,并显著提高了热胁迫基因CmHsp90、CmHsfA2、活性氧清除基因SOD的表达。低温胁迫处理下,转基因株系OE-5,OE-8的存活率分别为90%和85%,而野生型仅为10%,同时,抗寒相关基因COR413、COR6.6和抗逆基因rd29a的表达较处理前升高,且高于野生型。接种白色锈病病原菌32h时,转基因株系中CmDREBa-2的表达量激增,同时CmDREBa-2的过表达也不同程度地促进了病程相关基因PR1和PDF1.2的表达。其中,PR1基因的表达更为明显。综上,CmDREBa-2可能直接或间接调控胁迫相关基因增强菊花对高温胁迫和低温胁迫的耐受性。CmDREBa-2通过SA介导的抗病信号途径,参与菊花抵抗白色锈病反应。     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。     

栽培稻种间杂种不育性初步研究

栽培稻种间杂种不育是从非洲栽培稻向亚洲栽培稻转移有利基因及利用栽培稻种间杂种优势的最大生殖障碍,为克服栽培稻种间杂种不育障碍以充分、合理利用非洲栽培稻的有利基因,1999年至2001年在海南三亚用9个粳型亚洲栽培稻品种与2个非洲栽培稻品种杂交的17个F1组合,及与相应亚洲栽培稻回交的BC1F1为基本材料研究表明,F1所有组合均高度不育,回交一代花粉育性也很低,为0%～5.75%;在群体较大的BC1F1组合IRGC 102203/IRAT 216∥IRAT 216中选育性最高的1株(32.10%)自交得76株BC1F2,平均花粉育性为89.2%,之后种成76个BC1F3株系,每株系随机取1株自交至BC1F5,BC1F5的花粉及小穗育性基本正常,再随机取23个株系与IRAT 216测交,BC2F1的花粉和小穗育性均表现为半不育.说明这23个株系均带有来自非洲栽培稻亲本IRGC 102203的不育基因,不育基因同时作用于雄配子和雌配子,杂种不育的遗传模式主要表现为"单位点孢子体-配子体互作不育",经一代的选择和淘汰,育性基本恢复正常.大规模的回交转育育性基因及回交高世代QTL分析(AB-QTL)以更好地研究杂种不育的遗传规律及克服对策的研究工作正在进行中.