多抗转基因水稻植株的获得及其抗性鉴定

利用转Xa21基因(抗白叶枯病)纯合稳定的圣稻301与转Bt基因(抗螟虫)、转car基因(抗除草剂)的纯合稳定株系GK-1杂交,依据田间抗病虫性表现,利用标记基因选择,分子标记辅助选择,获得了多抗转基因水稻植株,其中某些多抗转基因水稻株系表现出良好的农艺性状和丰产潜力。     

水稻抗白叶枯病恢复系的分子育种

利用4类粳型亲籼系与携带有2个恢复基因Rf3、Rf4和4个抗白叶枯病基因Xa4、xa5、xa13和Xa21的品系构建回交群体，应用与目标基因紧密连锁的以PCR为基础的分子标记进行辅助选择（MAS）．在BC1F1选择到2个恢复基因和4个抗白叶枯病基因全杂合的植株19个．在BC1F2对19个当选株系进行MAS，共选择到28株至少含有4个纯合目标基因的单株，其中3个单株在6个目标基因座位上均带有纯合目标基因型．测交结果表明，选取的2个具6个纯合目标基因的单株对野败型细胞质雄性不育系有良好的恢复力．     

利用分子标记辅助选择聚合Xa4、Xa23和Pi9基因

利用常规回交育种结合分子标记辅助选择技术,将高抗水稻白叶枯病Xa4和Xa23基因、广谱高抗稻瘟病肿基因聚合到同一株系中,获得了三基因聚合的纯合株系。选用广西具有代表性的13个稻瘟病菌株、白叶枯病广致病型菌系P6和中国7个流行菌系对杂交后代进行人工接种鉴定,结果表明,聚合了Xa4、Xa23和pi9基因的株系09—371、09—375能同时抗白叶枯病和稻瘟病,对白叶枯病抗谱和抗性水平与供体材料W7相当,对稻瘟病的抗性与供体亲本75—1—127水平相当。Xa4、Xa23和Pi9三基因纯合株系可以作为水稻育种的多抗供体材料。     

Xa21全生育期表达载体的构建

利用PCR技术,以水稻品种明恢63基因组DNA与携Xa21完整基因组片段的载体pDBXa21作为模板,分别克隆了RSuS1启动子（RSP）、Xa21的开放阅读框至终止子的片段,并构建了RSP驱动水稻广谱抗白叶枯病基因Xa21的转基因表达载体。实时荧光定量PCR技术证实,水稻蔗糖合酶基因1（rice sucrose synthase gene 1,RSuS1）在水稻种子中低表达,在叶鞘与叶中全生育期高效表达。     

杂交稻恢复系白叶枯病(Xathonas campestris pv.oryzae)抗性改良研究

利用携有白叶枯病抗性基因 Xa-5,Xa-7的抗源 DV_(85)衍生而来、但经济性状明显改善的 TD-1、TD-2为抗病供体亲本,与对白叶枯病感染的杂交稻优良恢复系明恢63杂交,在对目标性状——抗白叶枯病持性的强烈选择压下,与轮回亲本回交2次。然后自交,以便于其它有利基因重组,通过按产量与抗性进行鉴定与选择,目前所选育的抗18、抗21、抗25用白叶枯病强菌株浙173接种为高抗(HR),且抗病性状在与感病不育系配组的杂种 F_1中呈完全显性表达。这此抗系与珍汕97A 杂交的 F_1杂种农艺性状都近似于汕优63——珍汕97A/明恢63,在江、皖、豫、鄂等白叶枯病病区的杂交稻生产上有应用前景。再继续回交1～2次,可望获得进行白叶枯病抗性研究的近等基因系遗材料。     

玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa25的水稻聚合育种

利用转玉米PEPC基因水稻HPTER(高感水稻白叶枯病)和抗白叶枯病水稻HX-3(具有抗白叶枯病基因Xa25)杂交,获得F1杂种,并对F1杂种进行花药培养,获得42株二倍体植株。通过对这些植株后代进行抗白叶枯病性鉴定,PEPC酶活性和光合速率测定及PCR检测,最后获得同时具有玉米PEPC基因和抗白叶枯病基因Xa25的水稻聚合株系7个,这些株系的农艺性状较HPTER有较大改善,可作为培育高产、抗白叶枯病水稻新品种的种质资源。     

含Cry1Ab和Xa21基因抗病虫水稻选育研究及其田间表现

 以稳定遗传的含Cry1Ab基因的抗虫水稻品种镇稻88和含Xa21基因的抗白叶枯病水稻品种圣稻301为亲本进行杂交，利用选择标记基因（bar基因和gus基因）和Southern杂交分析研究了转基因在杂交后代中的遗传分离规律和遗传稳定性。实验结果表明，在杂交后代中选择标记基因bar基因和gus基因分别与抗性基因Cry1Ab基因和Xa21基因紧密连锁并协同表达。Basta抗性检测和GUS活性的组织化学染色检测显示，Cry1Ab基因和Xa21基因在F2代中遵循9∶3∶3∶1的孟德尔遗传规律，F3代的部分株系中Cry1Ab基因和Xa21基因已稳定纯合；对F3代和杂交亲本的Southern杂交分析表明，Cry1Ab基因和Xa21基因可稳定地遗传。通过田间选育，获得了农艺性状优良的双抗（抗螟虫、白叶枯病）转基因水稻新品系SK-1、SK-2、SK-3，3个品系均对二化螟和白叶枯病菌表现出显著的抗性，产量高于镇稻88和圣稻301近20%，品质与镇稻88和圣稻301相近，部分指标优于这两个品种。     

转Xa21基因圣稻301的培育及其田间表现

利用农杆菌介导的遗传转化系统 ,将白叶枯病抗性基因Xa2 1导入山东主栽品种圣稻 30 1胚性愈伤组织 ,从T0 至T5代 ,利用GUS染色和分子标记辅助逐代选择并进行田间抗病虫性鉴定 ,获得了大量纯合稳定的转基因圣稻 30 1,并对其田间抗性及农艺性状表现进行了调查研究     

聚合抗稻白叶枯病双基因三系不育系R106A的选育研究

 中国杂交水稻的多数不育系不抗白叶枯病，携有单个的白叶枯病抗病基因的品种易于丧失抗性。本研究通过杂交、回交和自交将两个抗病基因聚合到不育系中，进行抗性改良。用育成的抗3418S（携有Xa21）为受体，CBB23(携有Xa23)为供体，通过1次杂交、1次回交和3次自交，采用足够大分离群体在分蘖前期进行接种初筛，再进行分子标记检测复筛，确认了目标基因的聚合，实现了均位于第11染色体上的Xa21和Xa23基因间交换重组，获得双基因纯合稳定的新品系R106。又用我们育成的矮败型不育系5801A进行转育，杂交一次后，向保持系（轮回亲本）定向选择，经回交3次迅速稳定，所育成的不育系及保持系对中国的7个病原型代表菌株均表现全生育期高度抗病，可能会大大延长其抗性寿命。并讨论了改良不育系抗性的研究方法、回交次数和选择世代等问题。论。     

分子标记辅助选择Xa23基因改良节水抗旱稻亲本的白叶枯病抗性研究

以携带抗白叶枯病基因Xa23的水稻材料‘CBB23'为供体材料,以优良节水抗旱稻保持系‘沪旱1B'为受体材料,采用杂交和回交的方式,在后代分离群体中利用与Xa23基因紧密连锁的SSR标记RM206进行分子标记辅助选择,同时将改良的保持系与不育系成对回交,通过分子标记检测、田间抗性鉴定和综合农艺性状选择,在BC_3F_5后代株系中获得Xa23基因纯合且表型与‘沪旱1B'相似的株系10份,以及与改良保持系回交3代的纯合不育系材料4份。使用P6菌系采用人工剪叶接种鉴定,发现纯合株系材料明显提高了对白叶枯病的抗性。     

利用Xa21基因改良杂交稻白叶枯病抗性

以转Xa 21基因的水稻优良恢复系BR527为抗白叶枯病基因供体,分别与不育系金23A、G46A、D62A、D200A进行组配,研究该基因在改良杂交水稻白叶枯病抗性方面的作用。分子检测表明,供体基因能够稳定遗传给杂交组合;田间接种鉴定发现杂交组合对P1,P2,P3,P4,P6和CII,CIV,CV等白叶枯病菌生理小种均表现出抗或高抗,揭示Xa 21基因的抗性好,抗谱广;农艺性状考察结果显示这些杂交组合的农艺性状与对照组合比较没有明显改变。说明该基因可以作为一个显性抗白叶枯病基因在杂交水稻抗性改良上上加以应用,与此同时,得到了四个白叶枯病抗性改良的优良杂交水稻组合。     

Production of Transgenic Anliucheng Sweet Orange (Citrus sinensis Osbeck) with Xa21 Gene for Potential Canker Resistance

Citrus canker, an epidemic quarantine disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri, has brought a great damage in citrus production worldwide. Herein, a rice PRR (pattern recognition receptor) gene Xa21 together with GUS reporter gene and hygromycin phosphotransferase gene (HPT) was introduced into Anliucheng sweet orange (Citrus sinensis Osbeck) via Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic callus. The transgenic calluses were screened on MT basal medium containing hygromycin (HYG) and detected by histochemical GUS staining. The transgenic plantlets were recovered through somatic embryogenesis pathway. The regenerated plantlets were accustomed to and maintained in the greenhouse. The transgene integration of recovered plantlets was identified by PCR and Southern blot hybridization. It showed that all the transgenic plantlets tested had undergone single copy integration, the expression of Xa21 in eight different transgenic lines detected by qRT-PCR can be divided into three grades, high for T5 and T6, middle for T4 and low for the rest. The tolerance to citrus canker disease of the three recovered transgenic lines T2, T4 and T6 was assessed by in vitro pin-puncture inoculation. The results showed that all the three transgenic lines conferred improved resistance to citrus canker bacterium infection and the T4 transgenic line displayed the highest resistance. The mechanism and feasibility of rice Xa21 in triggering innate immunity in citrus was briefly discussed.     

白叶枯病抗性水稻广亲和恢复系的鉴定和筛选

【目的】为采用分子标记辅助选择利用野生稻抗性基因提供科学依据,并为选育超级杂交水稻提供目标亲本和选育新的恢复系提供亲本。【方法】以白叶枯病抗性水稻中野5112为供体亲本、广亲和恢复系桂649为受体亲本进行有性杂交,将在分离群体中筛选的35份优良目标品系进行田间接菌鉴定,并用与水稻抗白叶枯病基因Xa23紧密连锁的SSR标记引物RM206对中野5112、恢复系桂649及其35份优良杂交后代F4材料进行分子检测。【结果】从桂649×中野5112杂交后代的35个F4品系中,筛选出13个同时具有白叶枯病抗性和广亲和性潜力及其他优良农艺性状的品系,其中属偏粳型11个,属偏籼型的仅有两个;供体材料中野5112及其13份杂交后代材料携有Xa23的抗性等位点,受体材料桂649及其他22份杂交后代材料未携带Xa23的抗性等位点。田间接菌鉴定结果表明,在37个检测材料中,除中野5112外,对白叶枯病表现中抗以上的有18个品系,进一步证明这部分材料已携带有Xa23基因。将13份携有Xa23抗性等位点的材料与籼、粳稻品种及不育系配组,根据其F1代的育性表现,证明其中12个品系具有广亲和性。此外,与对照汕优63相比,初步鉴定出适合广西种植的具有超高产潜力的杂交稻组合3个,即龙特甫A×100-1-4、龙特甫A×08262-2-1和龙特甫A×08278-1-1。【结论】采用SSR标记引物与PCR检测方法进行Xa23基因分子标记检测是可行的,这为采用分子标记辅助选择利用野生稻抗性基因提供科学依据。筛选出的13份优良品系可用作选育超级杂交水稻的目标亲本或选育新恢复系的亲本。     

粳稻抗虫转基因保持系的研究

利用基因枪转化法,以优质粳稻保持系早花二B为受体,获得了含有GNA和Hyg基因的转基因植株。对T2产生的6个纯合株系进行多代潮霉素筛选、PCR分子检测及稻飞虱接种鉴定,表明标记基因在受体中稳定遗传,并高效表达,且一经纯合不再分离;而目的基因表达效果不一样,只有T-10(克隆号A5-32)表达效果最好,其抗虫性达到中抗(MR)以上水平,比受体抗性(S)明显提高。将转基因保持系与不育系早花二A回交,获得的转基因不育系高抗潮霉素,且抗性也完全纯合,表明转基因保持系的抗性基因已转化到不育系中,并得到高效表达。     

农杆菌介导籼稻Xa21基因的转化及其遗传研究

应用农杆菌介导转化体系，成功地将Xa21基因导入籼稻幼胚来源的愈伤组织，获得籼稻优良恢复系T461、优良常规品种粤香占和中1063个品种共33个独立的转基因株系。PCR和Southern分析结果表明，Xa21基因已整合到转基因植株基因组中。接种分析表明，T0代转基因植株的白叶枯病抗性得到不同程度的提高，转基因植株自交T1代白叶枯病抗性表现出分离，且大多为1-2个整合位点的孟德尔方式遗传，与Southern分析结果一致。     

Xa21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体 ,经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因 Xa2 1导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系 SWR2 0中 ,共获得 4 3个独立的转基因株系 ,1 0 0余株转基因水稻植株。经 GUS活性、潮霉素抗性检测及PCR分析表明 ,外源基因已整合到转基因水稻基因组中 ;白叶枯病原菌接种试验表明 ,大部分 T0 代转基因水稻植株的抗病性有明显提高 ,多数植株表现抗或高抗 ,个别为感病。经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后 ,GUS瞬间表达率可高达 92 .5% ,稳定转化频率达到 2 7.6%     

基因枪介导转化水稻花药愈伤获得抗白叶枯病转基因植株

以质粒pBI121作外源DNA，对基因枪介导转化水稻花药愈伤的有关参数进行了优化，优化值分别为射程9cm，枪膛氦气压力1100psi，真空度3600－3733Pa，轰击次数2次。轰击前后愈伤经0.4mol/L甘露醇处理可提高转化效率。在优化条件下将Xα21基因导入籼型光敏核不育水稻W9451S，获得了单倍体植株，经人工染色体加倍得倒二倍体转基因植株。白叶枯病菌接种鉴定结果表明其抗性有明显提高。