猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

 【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90％以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。     

猪链球菌病二联灭活疫苗的研制

以马莲球菌兽疫亚种（Stretococcus equi subsp.zooepidemicus)ATCC35246株和猪链球菌2型（S.suis type2)HA9801株作为生产菌株，制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗，经过无菌及安全检验合格，肌肉接种仔猪。每头2mL。免疫15d后，对HA9801和ATCC35246的保护率分别为100%（26/26）和92.3%(24/26)。用二联灭活苗免疫后4周内仔猪体内抗体水平持续上升，从第5周开始逐渐下降；再次免疫后，抗体水平迅速回升，120d后仍维持较高水平，攻毒保护试验和抗体消长规律的测定显示，制备的猪链球菌病二联灭活苗具有良好的免疫保护作用。     

猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

马链球菌马亚种与马链球菌兽疫亚种联合免疫小鼠效果分析

为比较与评价马链球菌马亚种ZZM3-M株和马链球菌兽疫亚种ZZM2-S株联合免疫效果,本研究选取ZZM3-M株和ZZM2-S株分离菌株作为免疫原菌株,对两株菌灭活并免疫昆明白小鼠,通过对小鼠抗体效价、抗体分型检测、攻毒保护力、菌体载量及病理组织学观察实验评价联合免疫后的保护效果。结果显示,ZZM3-M+ZZM2-S联合免疫组及ZZM3-M、ZZM2-S单独免疫组均可诱导特异性抗体产生,且联合免疫组抗体效价可达1∶8100,联合免疫组对ZZM3-M和ZZM2-S的免疫保护率分别为90%和100%,优于这两种菌株单独免组,联合免疫诱导的抗体亚型以IgG1为主,菌体载量检测显示联合免疫组可有效减少脏器的损伤,病理组织学观察显示联合免疫可显著减轻改善这两种菌引起的病理损伤。     

类M蛋白对HEp-2细胞的黏附作用

采用通用的模式细胞HEp 2作黏附及黏附抑制试验 ,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6株类M蛋白的黏附作用。结果表明 ,ATCC35 2 4 6株可以黏附HEp 2细胞。用重组表达的类M蛋白鼠抗血清处理ATCC35 2 4 6 ,可抑制其对HEp 2细胞的黏附 ,最大抑制率达 81 4 % ;而ATCC35 2 4 6的全菌鼠抗血清在 1∶80 0时能完全抑制它对HEp 2细胞的黏附。此外 ,热酸提取的ATCC35 2 4 6株的类M蛋白和重组表达的类M蛋白可不同程度地抑制该菌株的黏附 ,前者在 16 0μg·mL-1有最大的黏附抑制率 ( 4 0 % ) ,而后者在 6 0 μg·mL-1的黏附抑制率可达最高值 ( 2 3% )。结果显示 ,类M蛋白是ATCC35 2 4 6株的黏附素之一 ,在对细胞的黏附过程中发挥作用     

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

马链球菌兽疫亚种的研究进展

<正>猪链球菌病是当今危害养猪业的一种重要细菌性疾病,严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus,SEZ)是引起我国猪链球菌病的主要病原之一。SEZ主要引起猪败血症、脑膜炎、关节炎,肺炎以及突发性死亡等症状~([1])。此外,该菌能感染马、牛、羊、猫等多种动物,实验动物小鼠、兔对该菌也极为易感~([2])。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。     

枣MAPK基因片段克隆与分析

采用同源基因克隆法,首次获得了枣MAPK基因片段543 bp,经Blast比对,该序列与湖北海棠(Malus hupehensis EF427897.1)、蓖麻(Ricinus communis XM002509805.1)、西府海棠(Malus micromalus AF435805.2)和欧洲山毛榉(Fagus sylvatica AJ784997.1)的相似率分别为86%、86%、85%和84%。进一步进行系统进化分析,证明该基因属于MAPK中TEY型的B类。     

猪链球菌rpoE基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆猪链球菌rpoE基因,并通过生物信息学软件预测分析猪链球菌rpoE基因编码蛋白功能及其调节机制。以猪链球菌基因组为模板扩增rpoE基因,成功测序后通过生物信息学软件预测该基因编码蛋白的理化性质、抗原表位等。结果表明,成功克隆的猪链球菌rpoE基因全长582 bp,编码一种富含谷氨酸、天冬氨酸及丝氨酸的亲水性胞质蛋白;二级结构分析显示,RpoE蛋白主要结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,分别占52.3%和36.3%。综合分析认为,RpoE蛋白上存在5个优势抗原表位。     

牛源无乳链球菌CAMP因子(cfb)的克隆及原核表达

提取能产生CAMP反应的牛源无乳链球菌山东分离株的基因组DNA,PCR扩增CAMP因子基因,重组到pMD18-T载体中.测序结果表明,扩增片断含有768 bp的ORF,可编码含255个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的无乳链球菌CAMP因子蛋白的氨基酸组成相比, 第8位Tyr→Cys,第95位Pro→Ser,第126位Thr→Ala的3个氨基酸发生了点突变,同源性为98.4;.成功构建原核表达载体pET32a+/cfb,SDS-PAGE分析蛋白质表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为48 kD,表达量占菌体总蛋白的52.7;.这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件.     

文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

采用Trizol法提取文心兰花期花葶总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了文心兰GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的2个部分序列,长度均为875 bp,编码291个氨基酸残基.序列分析结果表明,与其它已登录物种的GAPDH基因相比,其核苷酸序列的同源性均在79％以上,与蕙兰(JN177724.1)同源性高达到92％,氨基酸序列的同源性也在85％以上;且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性.本研究已克隆出文心兰GAPDH基因的部分cDNA同源序列片段,分别命名为OnGA1和OnGA2,并在GenBank注册,登录号分别为JN981141和JN981142.     

复叶槭FtsZ基因cDNA片段的克隆及RNA干扰载体的构建

利用简并引物RT-PCR,首次从复叶槭中克隆到569 bp的FtsZ基因cDNA片段,其与GenBank已经登录的FtsZ基因氨基酸序列的同源性为96.90%,并具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。从上述序列中选取300 bp的序列,分别克隆其正、反义基因片段,同时,克隆GUS基因的1个内含子,作为间隔区基因。将正义、间隔区和反义3个基因片段串联,插入到植物表达载体p3300-35ST中,构建复叶槭RNA干扰载体p35ST-AnFtsZi。为接下来遗传转化、培育复叶槭彩叶新品种奠定基础。     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006-2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记( RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明：经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌; RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。     

燕麦Actin基因片段的克隆及序列分析

【目的】克隆与分析燕麦肌动蛋白基因片段.【方法】根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以燕麦叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,进而转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞.阳性克隆经PCR鉴定后进行测序.【结果】扩增片段长678bp,共编码225个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的同源性均在85%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的同源性达93%以上.【结论】系统进化分析表明,扩增到的燕麦肌动蛋白基因与羊草、长穗偃麦草和黑麦草等植物的肌动蛋白基因亲缘关系最为密切.     

水葫芦肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

利用植物肌动蛋白保守片段设计简并引物,通过RT-PCR 扩增出水葫芦肌动蛋白基因片段并连接到 pMD19-T 载体,转化E. coli,测序。序列分析结果表明,该序列与油棕、小“果蕉等植物的相似性程度达到85%以上, 分子进化分析水葫芦肌动蛋白基因序列与油棕、小“果蕉等单子叶植物亲缘关系较近,但并没有与某些植物的肌动 蛋白很好地聚成一类。本研究所克隆得到的水葫芦肌动蛋白基因序列能够为进一步研究水葫芦其他基因的表达提 供内标。     

青天葵HMGR 基因片段的鉴定 和生物信息学分析

采用生物信息学对青天葵转录组测序获取的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段Nf HMGR及其编码蛋白进行功能鉴定和表达分析。结果表明,Nf HMGR基因片段序列长度为1 563 bp,与其他植物HMGR基因的同源性最高可达88%;编码含有521个氨基酸、分子量约为55.34 ku的亲水性不稳定蛋白。Nf HMGR蛋白具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶Ⅰ类酶功能域,归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族,包含3处跨膜结构域,不含任何信号肽、转运肽,二级结构表现为混合型结构蛋白质。在青天葵不同组织中,Nf HMGR基因在球茎中的表达量高于在叶片中的表达量。