猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。     

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。     

马链球菌马亚种与马链球菌兽疫亚种联合免疫小鼠效果分析

为比较与评价马链球菌马亚种ZZM3-M株和马链球菌兽疫亚种ZZM2-S株联合免疫效果,本研究选取ZZM3-M株和ZZM2-S株分离菌株作为免疫原菌株,对两株菌灭活并免疫昆明白小鼠,通过对小鼠抗体效价、抗体分型检测、攻毒保护力、菌体载量及病理组织学观察实验评价联合免疫后的保护效果。结果显示,ZZM3-M+ZZM2-S联合免疫组及ZZM3-M、ZZM2-S单独免疫组均可诱导特异性抗体产生,且联合免疫组抗体效价可达1∶8100,联合免疫组对ZZM3-M和ZZM2-S的免疫保护率分别为90%和100%,优于这两种菌株单独免组,联合免疫诱导的抗体亚型以IgG1为主,菌体载量检测显示联合免疫组可有效减少脏器的损伤,病理组织学观察显示联合免疫可显著减轻改善这两种菌引起的病理损伤。     

猪链球菌病二联灭活疫苗的研制

以马莲球菌兽疫亚种（Stretococcus equi subsp.zooepidemicus)ATCC35246株和猪链球菌2型（S.suis type2)HA9801株作为生产菌株，制备氢氧化铝胶二联灭活疫苗，经过无菌及安全检验合格，肌肉接种仔猪。每头2mL。免疫15d后，对HA9801和ATCC35246的保护率分别为100%（26/26）和92.3%(24/26)。用二联灭活苗免疫后4周内仔猪体内抗体水平持续上升，从第5周开始逐渐下降；再次免疫后，抗体水平迅速回升，120d后仍维持较高水平，攻毒保护试验和抗体消长规律的测定显示，制备的猪链球菌病二联灭活苗具有良好的免疫保护作用。     

一株猪源停乳链球菌类马亚种的分离鉴定

【目的】停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）可引起猪关节肿大和运动障碍，大大降低饲料报酬和猪场经济效益，近年研究提示停乳链球菌类马亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis）是一种潜在的人兽共患病病原。对猪源停乳链球菌类马亚种进行研究，可为防治该病提供数据，具有公共卫生意义。【方法】2022 年 3 月广东省某规模化猪场出现仔猪关节肿大和跛行症状。为确定病因，无菌采集发病仔猪关节液进行细菌分离培养，对优势菌进行形态观察、生化鉴定、16S rDNA 基因序列分析、小鼠致病性试验及抗生素敏感性试验，并对其毒力基因进行 PCR 鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、生化特性，结合 16S rDNA 序列测定与在线 BLAST 分析结果，确定其为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。药敏试验结果表明，分离菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素 G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星敏感，对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素 B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感，而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性。毒力基因 PCR 鉴定结果表明，分离菌株的基因型为 eno+napr+cfb-lmb+bca-bac-scpB+cyl+。小鼠致病性试验结果表明，分离菌株导致小鼠内脏病变和死亡，具有显著的致病性。【结论】首次报道了华南地区有关致病性猪源停乳链球菌病例，研究结果为临床猪源停乳链球菌病的防治提供参考。     

家禽病例中马链球菌兽疫亚种的分离鉴定及致病性观察

为研究马链球菌兽疫亚种对家禽的致病性,采集流行地区发病鸡和鸽的肺脏,分离了8株链球菌,并利用染色镜检、生化试验和PCR方法进行鉴定,结果为3株属马链球菌兽疫亚种,5株属粪肠球菌。在此基础上,选择1株马链球菌兽疫亚种内蒙分离株,经腹腔注射途径人工感染SPF (Specific pathogen free chicken) 鸡和肉鸡,攻毒后死亡率分别为40%和80%。剖检观察到出血性肺炎、气囊炎和心包炎,尤其是肉鸡出现60%的支气管栓塞病变,这与临床病理学变化相似。此外,采用微量肉汤测定法测定8个临床分离菌株测定对15种药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibition concentration,MIC),结果显示10株链球菌对于氟苯尼考、莫西沙星、甲磺酸加替沙星、乳酸环丙沙星及强力霉素高度敏感,MIC值均小于7.813 μg/mL。分离株对于泰乐菌素、磷霉素钠、螺旋霉素和阿莫西林高度耐药,MIC值大于250 μg/mL。试验提示马链球菌兽疫亚种可能是家禽气囊炎一个重要的病原之一,临床防治中应使用敏感性高的抗菌素。     

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌2型分离株HA9801的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF），制备其抗体。用此抗体建立了Dot-ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35246和HA9801为阴性和阳性对照，检测17株猪源链球菌和1株猪链球菌2型人分离株。结果显示，两种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61％（11／18）。     

四川鲟源海豚链球菌的毒力基因谱及分子分型

【目的】明确四川鲟源海豚链球菌Streptococcus iniae的毒力谱及分子流行病学特点,为鲟海豚链球菌病的防控提供参考。【方法】对四川地区17株鲟源海豚链球菌以及海豚链球菌ATCC29178进行毒力基因多重PCR检测,并通过随机扩增多态性DNA(RAPD)和重复序列PCR(REP-PCR)分析进行分子分型。【结果】所有菌株的7个主要毒力基因pgm、 scpI、 simA、 cpsD、 sagA、 pdi和cfi均为阳性,部分菌株的simA基因发生了变异。基于RAPD分析,18株菌分为Ⅰ、Ⅱ2个基因型;基于REP-PCR分析,18株菌分为A、B、C、D 4个基因型。【结论】四川地区17株鲟源海豚链球菌分离株均为强毒株,毒力谱为pgm/scpI/simA/cpsD/sagA/pdi/cfi,并且同时存在多种基因型的菌株,其中D型为优势流行型。     

猪链球菌1998分离株病原特性鉴定

对１９９８年江苏分离的３株猪源链球菌进行了鉴定,其形态、染色均符合链球菌的特点,具α或β溶血,生化试验结果不稳定。用国际通用的链球菌乳胶分型诊断液检测上述分离株,均不在其检测范围,即不属于链球菌兰氏分群的Ａ～Ｇ群。但它们凝集猪链球菌２型抗血清,人工接种兔有致病性。表明此次流行的猪败血症的病原不同于以往的Ｃ群链球菌,不是马腺疫链球菌兽疫亚种,而是属于Ｒ群的猪链球菌２型。     

中华鳖细菌疫苗免疫佐剂的筛选及其初步应用

将分离自中华鳖Trionyx sinensis主要细菌性疾病—肠道出血性败血症、鳖穿孔病（疖疮病）、红脖子红底板病、鳖腐皮病的4株病原菌,在体积分数为3．5％的福尔马林溶液中灭活24h。在灭活的4株菌中添加不同佐剂,充分混匀后分别制备成总含菌量为6×10^9个／mL的4价菌苗,分别免疫8只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。经3次免疫后,随机选3只小鼠抽血制备血清,用间接ELISA方法测定抗体效价,除空白对照组外,其它4组小鼠的免疫血清效价为1：1．6×10^4-1：2．56×10^5,各免疫组的效价依次为弗氏佐剂〉白油佐剂〉蜂胶佐剂〉不加佐剂。另外5只小鼠用于免疫保护性试验。结果表明：3种佐剂的免疫保护率均为100％,而不加佐剂组免疫保护率为80％,空白对照组死亡率为100％。考虑到弗氏佐剂的成本较高且白油佐剂有副作用,故选择蜂胶作为免疫佐剂,制备了中华鳖4价菌苗。用该菌苗免疫接种50只体重为100～150g／只的健康中华鳖,注射剂量为0．2mL／只,并设置对照组（注射等量的生理盐水）,共接种20只健康中华鳖。分别于免疫后第20、30、40、50天随机采集3只受免疫的中华鳖和对照组的1只中华鳖血液并制备血清,用浙江省淡水水产研究所制备的针对中华鳖IgM的单抗3H3介导的ELISA方法,测定血清中的抗体效价。结果表明：当中华鳖免疫后40d,血清中抗体效价达到最高,为1：6．4×10^4;免疫后50d将受免中华鳖分成4组,分别用4种菌株以5LD50（9×10^6个／mL）进行攻毒试验（0．5mL／只）,结果免疫保护率均达到100％,而对照组死亡率均为100％。     

鸡大肠杆菌多价灭活菌苗的研制和应用

从大肠杆菌血清型为O78标准株及O78、O119的34个地方分离株中筛选出3个强毒菌株,作为制苗基础菌株,并加入发病鸡场的自家分离株,一起作为制苗菌种。于酵母肉汤中培养18~24 h。甲醛灭活后,制成鸡大肠杆菌多价自家灭活铝胶苗。试验表明,该苗接种雏鸡0.5 ml,成鸡1 ml,无毒副作用;鸡只免疫后,对同型菌株近期攻毒后的保护率为100%;鸡只免疫后12周,血清中抗体平均凝集价为1∶33.6,高于免疫临界线1∶16,并且鸡群健康状况稳定,增重加快,饲料利用率和产蛋率增加。     

牛源金黄色葡萄球菌突变株的筛选、鉴定及其免疫原性的研究

 【目的】诱变牛源金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb),筛选、鉴定弱毒性突变株,并研究其在鼠上的免疫交叉保护性。【方法】牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb,经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)化学诱变,经生长特性、回复突变、毒力检测、LD50、多种特征性酶检测、小鼠中免疫保护性等实验比较研究了突变株与亲本株的生物学特性,筛选得到遗传性状稳定β－溶血素缺失的弱毒性突变株。【结果】弱毒性突变株Hx与亲本株相比：其β－溶血性状完全缺失,生长缓慢,耐热核酸酶、血浆凝固酶等胞外蛋白的产量减少,在活体条件下可产生荚膜,半数致死量(LD50)10－1.83•mL-1远低下于亲本株的10－4.33•mL-1。亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死量是未接种过的6—50倍。非亲本株保护检测,免疫接种过的鼠的半数致死率是未接种过的5—60倍。【结论】突变株Hx的β－溶血素缺失,毒性减弱,对金黄色葡萄球菌攻击具有较高免疫保护性。     

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.     

草鱼细菌性败血症病疫苗的研究

制备出草鱼细菌性败血症灭活菌苗并以口服方式免疫鱼群 ,剂量为 :每公斤草鱼每次服用含菌数为 1× 10 10CFU的灭活菌液。拌料投喂 3d ,每天 3次 ,为一个免疫疗程。结果表明免疫 15d后产生免疫力 ,而且强毒攻击有70 %～ 80 %保护率 ,免疫期至少 3个月。现场应用效果良好 ,无任何副作用及不良反应 ,其发病率可降低 35 %以上。     

天津地区4株禽多杀性巴氏杆菌的交互免疫分析

用禽多杀性巴氏杆菌４ 株分离菌和标准菌株分别制备油乳剂灭活苗免疫鸡,接种３ 周后分别用强毒菌攻击,观察５ 株菌之间的交互保护作用。结果分离菌 Ｔ Ｊ８ 株交互免疫效力优于标准菌株和其它３ 株分离菌。     

转基因玉米表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白免疫原性鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(TGEV-S)在转基因玉米中的表达及对试验小鼠的免疫原性,本试验在前期TGEV-S转基因玉米植株构建成功的基础上,自玉米叶片中抽提可溶性蛋白作为包被抗原,建立筛选表达TGEV-S转基因玉米的间接ELISA检测方法。结果显示在92份被检测植株中8株为阳性,取阳性值较高的2株152-3和156-6,提取叶片可溶性蛋白,与弗氏佐剂乳化后皮下注射免疫小鼠,只有植株156-6中可溶性蛋白免疫小鼠可产生针对TGEV的抗体,而152-3免疫组检测结果为阴性。利用156-6植株叶片对小鼠进行灌胃免疫,也可产生针对TGEV的特异性抗体。以上结果表明,获得的TGEV-S转基因玉米植株不但可表达TGEV-S蛋白,而且该蛋白通过注射或口服途径免疫小鼠后均可产生针对TGEV-S的特异性抗体,提示TGEV-S转基因玉米具有发展成为TGEV口服疫苗的潜力。