PEDV N蛋白的原核表达纯化及B细胞抗原表位预测分析

本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。     

猪细小病毒7型Cap基因原核表达与生物信息学分析

利用PCR方法扩增猪细小病毒7型(porcine parvovirus 7,PPV7)的Cap基因,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-Cap,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定。同时使用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和跨膜结构域等。结果表明,成功从病料中扩增到Cap基因并构建获得重组质粒pGEX-6P-1-Cap,诱导表达出大小约为78 ku的Cap蛋白,与预期相符。诱导获得的Cap蛋白能够与GST单抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。生物信息学分析结果显示,该蛋白是亲水稳定蛋白,二级结构中以无规则卷曲(c)结构居多,占62.90%,α螺旋(h)、β转角(t)、延伸链(e)分别占11.09%、4.05%、21.96%,无信号肽区域和跨膜结构域,存在62个磷酸化位点,12个B细胞抗原表位,2个CTL表位和3个Th表位。本研究成功表达了PPV7 Cap蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白质的生物学功能相关研究提供参考。     

猪流行性腹泻病毒Nsp5基因的原核表达及生物信息学分析

旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。     

猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

为了解猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况,对新分离的FIPV AH1905株的N基因进行了克隆和序列比对分析,并利用生物信息学软件对N基因编码蛋白的二级结构进行了预测。最后,将N基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在原核细胞中进行表达,并制备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPV AH1905株的N基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸。序列比对分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷酸同源性为90.2%~92.4%,氨基酸同源性为91.8%~93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支,同属于FIPV基因Ⅰ型。对N蛋白二级结构预测结果显示,该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点,含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位和2个Th表位。Western blot检测结果证明,N蛋白在大肠埃希菌细胞中主要以包涵体形式大量表达,相对分子质量约为68 ku,具有良好的反应原性。以上结果可为进一步开展FIPV的流行病学和分子生物学研究奠定基础。     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

细粒棘球蚴RTN4基因的克隆及序列分析

【目的】克隆细粒棘球蚴(Eg)内质网膜蛋白4(Reticulon-4,RTN4)抗原基因,对其序列进行生物信息学分析。【方法】采集感染Eg的绵羊肝脏和肺脏,提取Eg头节总RNA为模板,对RTN4基因进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,对其核苷酸序列及氨基酸序列进行生物信息学分析。【结果】Eg RTN4cDNA全长654bp,编码217个氨基酸,蛋白质分子质量为25.3ku,等电点为8.83。编码氨基酸序列中含有1个N端酰基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个蛋白激酶C磷酸化位点。经生物信息学软件预测,RTN4蛋白的抗原表位区主要集中在第1-47位、第71-147位和第171-217位区域;含有2个高度疏水区,2个跨膜区,膜外区分别位于第1-47位和第171-217位。【结论】成功克隆了Eg RTN4基因,预测了其编码蛋白抗原的结构和表位。     

斯氏副柔线虫SHR基因表达载体的构建及生物信息学分析

为探讨斯氏副柔线虫免疫相关SHR基因作为疫苗候选抗原及早期诊断抗原的可能性,提取斯氏副柔线虫的总RNA,用RT-PCR技术扩增SHR基因,并将PCR产物克隆到pMD19-T载体,构建原核表达载体pET-30a(+)-SHR,利用在线软件对该基因编码蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆获得SHR基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸,理论等电点为6.09,无信号肽和跨膜区;磷酸化预测含有29个磷酸化位点;结构分析发现,α-螺旋构成二级结构的主要成分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,SHR蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白。推测SHR有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。     

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析

试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒结构蛋白基因的克隆及其B细胞抗原表位的预测

[目的]以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据,应用生物信息学相关软件和方法,对BVDV结构蛋白( Structural Protein,SP)的二级结构的不同方面及其B细胞表位进行了预测,综合评价了BVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位,并计算出一些潜在的抗原位点.[方法]利用RT- PCR扩增法获得牛病毒性腹泻病毒结构蛋白序列,通过克隆、测序分析结构蛋白基因的基因组序列和蛋白序列,采用DNAStar Protean软件对结构蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行综合分析,并预测其B细胞的抗原表位分布.[结果]P14、gp48和gp53蛋白含有的细胞优势抗原表位较多,有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用.[结论]与已鉴定的B细胞抗原表位相比,试验所用方法预测的结果有较高的准确度,是一种较为先进的表位研究方法.     

一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因分型及rpoE基因生物信息学分析

为分析本实验室分离保存的一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和rpoE基因编码蛋白的生物特性,通过16SrDNA、特异性基因、荚膜分型、脂多糖分型、rpoE基因扩增等分子生物学和生物信息学方法对此株牦牛源多杀性巴氏杆菌进行分析。结果表明:此株牦牛源多杀性巴氏杆菌为B∶L2∶ST44基因型,rpoE基因和印度牛源多杀性巴氏杆菌rpoE基因相似性为100%,分子量22.0ku,理论等电点4.86,属于不稳定、无跨膜结构、无信号肽、有保守结构域和有潜在磷酸化的胞内亲水性蛋白,二级结构α-螺旋占比最高67.02%,三级结构为棒状微弯曲模型,存在多个抗原表位,预测可与10个蛋白存在相互作用。综上,本研究对一株西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌进行基因分型和rpoE基因进行生物信息分析,为进一步了解西藏牦牛源多杀性巴氏杆菌基因型和探索RpoE蛋白的生物学特性提供数据参考。     

奶牛隐性乳房炎三种致病菌的多重PCR检测方法的建立

为建立快速并能同时检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种奶牛隐性乳房炎致病菌的方法,根据无乳链球菌16S rRNA基因、金黄色葡萄球菌NUC耐热基因、绿脓杆菌ETA基因序列并参考文献各合成一对特异性引物,通过对PCR反应各项参数的调整优化,建立多重PCR检测体系,并同时进行灵敏性试验和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出无乳链球菌270 bp、金黄色葡萄球菌153 bp和绿脓杆菌375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1 500 bp的通用片段,而对于其他的6种病原菌只能扩增出1 500 bp的通用片段,具有较强的特异性。三种特异性引物扩增条带与GenBank上的细菌基因序列同源性为99%。增菌培养24 h,该体系对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低灵敏度分别为8×10⁴、4×10⁴、1.5×10⁵ CFU·mL^-1。本研究建立的检测方法能够完成无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的快速检测,对于生产上奶牛隐性乳房炎的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。     

薄荷Eβf合成酶基因(Tspa11)的克隆、序列分析与表达特性

采用室温贮藏的方法，研究贮藏时间对大红袍花椒和青花椒品质性状的影响。结果表明，贮藏1、2、3 a时，大红袍花椒果皮麻味素含量和脂肪酸含量降低，分别较对照（当年）降低14.4%、50.8%、69.7.0%和2.0%、10.0%、14.0%，青花椒分别降低11.0%、40.5%、44.2%和6.5%、21.7%、22.8%。种子贮藏1、2、3 a时，大红袍花椒和青花椒脂肪酸含量分别较对照（当年）降低了0.98%、19.6%、20.2%和2.2%、15.3%、22.4%。同时，脂肪酸组分含量受贮藏时间的影响显著。贮藏1 a时，大红袍花椒和青花椒果皮亚麻酸含量分别较对照提高19.2%和26.9%（P＜0.1），贮藏3 a时，分别减少27.6%和35.8%（P＜0.1），亚油酸含量分别减少22.2%和15.7%。贮藏1 a的花椒果皮氨基酸含量显著提高，但随时间延长，其含量降低。同时，贮藏1 a时，大红袍花椒果皮中天冬氨酸、脯氨酸、胱氨酸和精氨酸含量分别较对照提高45.2%、55.4%、66.7%、128.6%（P＜0.1），青花椒果皮中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量分别较对照提高40.8%、30.7%和60.9%（P＜0.1）。室温条件下，花椒保存时间以1 a以内为宜。     

奶牛乳房炎重要候选疫苗蛋白的抗原表位分析及三联重组表位疫苗的氨基酸序列设计

为设计奶牛乳房炎三联重组表位多肽疫苗,选取奶牛乳房炎3种主要感染菌的候选疫苗蛋白:金黄色葡萄球菌的Ebps与ClfA,大肠埃希菌的OmpA与OmpC,链球菌的SIP与PGK,通过ABCpred和BepiPred方案,预测获得每种蛋白各有2个优势B细胞表位;利用神经网络与量化矩阵法预测蛋白的CTL表位。结果显示,SIP蛋白无CTL表位,其余蛋白均存在1个CTL细胞表位;采用MHC-Ⅱ类分子结合肽在线程序预测蛋白的Th表位,结果发现每种蛋白各有1个Th细胞表位。使用DNASTAR软件分析6个蛋白的二级结构,结果发现,预测获得的B/T细胞表位大多处于蛋白易于产生表位的暴露表面、无规则卷曲与转角等位置。再通过Protean程序重组拼接获得的B/T细胞抗原表位,最终设计获得抗原性较好的三联表位疫苗氨基酸序列。为新型奶牛乳房炎三联表位疫苗的研制奠定基础。     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

芥蓝1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因BaDXS1的克隆及原核表达

本研究以芥蓝为实验材料,采用同源克隆的方法分离出BaDXS1基因,其开放阅读框为2 139 bp,编码712个氨基酸。理化性质分析表明,BaDXS1蛋白的分子量为77.21 ku,等电点pI为8.59,不含跨膜区域,位于植物细胞叶绿体内。氨基酸序列比对发现,芥蓝DXS1与甘蓝、拟南芥、烟草、番茄等植物的DXS蛋白序列的一致性达到79%以上;系统进化树分析显示,芥蓝DXS1与甘蓝DXS的亲缘关系最近。构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-BaDXS1,并对其进行诱导表达,发现该蛋白在大肠埃希菌体内主要以包涵体的形式存在。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位

对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了rDi-NDPK的诊断价值。免疫印迹显示,Di-NDPK具有良好的反应原性,免疫荧光组化显示,Di-NDPK在犬恶丝虫的侧索及肠上皮细胞和肠腔中分布。间接ELISA显示,该方法的敏感性为66.7%(16/24),特异性为38.9%(14/36),其中与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应。Di-NDPK是一个分泌蛋白,但不适合作为犬恶丝虫病的诊断候选抗原。     

华山松大小蠹2个甲羟戊酸路径基因的克隆与表达

香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸（G/FPPS）和异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶。通过克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因的全长序列，预测基因和编码蛋白的性质、结构和功能，并对序列特征和不同发育时期（幼虫、蛹、初羽化期成虫和扩散期成虫）以及不同组织（头、前中肠、后中肠、后肠和剩余躯体）DaG/FPPS和DaIDI表达的研究，旨在揭示DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹信息化学物质合成中的分子调控机制。采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因，DNAStar、Blast、ExpasyProtscale、SignalP 4.1、PSORT和TargetP等多种生物信息学方法对基因全长cDNA序列、基本理化性质、系统进化关系、信号肽和蛋白亚细胞定位等进行分析。用Real-time PCR检测DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹不同发育时期和不同组织中的表达。结果表明，克隆获得华山松大小蠹香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸DaG/FPPS和异戊二烯焦磷酸异构酶DaIDI全长cDNA序列，分别命名为DaG/FPPS和DaIDI，DaG/FPPS编码的氨基酸序列与山松大小蠹DpF/GPPS相似度最高达95%，氨基酸序列含有一个RALS 四肽基序、7 个异戊烯基转移酶保守区（Ⅰ-Ⅶ）和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区；DaIDI编码的氨基酸序列与山松大小蠹IDI相似度最高，达到92%。Expasy Protscale结果表明DaG/FPPS蛋白疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸，推测其为疏水性蛋白，而DaIDI蛋白亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸，故推测DaIDI为亲水性蛋白，有较好的水溶性。信号肽预测结果表明，DaG/FPPS和DaIDI均不含信号肽，TargetP结果表明，DaG/FPPS和DaIDI蛋白含线粒体靶向肽，结合PSORT结果推测DaG/FPPS和DaIDI均定位于线粒体。华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI在不同发育时期和不同组织中均有表达，其中完全羽化期与扩散期成虫保持一致，该阶段表达量最高，不同组织中前中肠表达量最高。