牛源皮特不动杆菌对小鼠的致病性分析

为探究来源于牛呼吸道疾病综合征发病牛的皮特不动杆菌对小鼠的致病性,对其进行相关毒力基因的检测和小鼠致病性试验,试验内容主要包括临床症状观察、病理剖检、组织病理学观察,以及半数致死量(LD₅₀)和各器官载菌量的测定。结果显示,牛源皮特不动杆菌ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9菌株对小鼠均具有较强的致死性,对小鼠的LD₅₀分别为4.487×10⁷ CFU·mL^-1和3.177×10⁸ CFU·mL^-1。剖检死亡小鼠可见,牛源皮特不动杆菌主要造成小鼠皮下充血、肺淤血肿胀、肠道积气积液等症状,可引起心、肝、脾、肺、肾、脑等多种器官感染。组织病理学观察显示,小鼠各器官病变均较轻微,主要表现在肝、肺中有少量炎性细胞浸润,脾中白髓细胞坏死和纤维增生,其中ZZCNC1807-6攻菌组的病变较ZZCSF1807-9攻菌组相对严重。载菌量分析结果显示,2株菌对小鼠肝、心、脾、肺和肾的侵袭力差异不大,但ZZCNC1807-6对脑的侵袭力强于ZZCSF1807-9。综上,ZZCNC1807-6菌株的毒力强于ZZCSF1807-9。     

圈养大熊猫蠕虫病感染情况调查

为了解圈养大熊猫蠕虫病感染情况,采用饱和硫酸镁离心漂浮法对从四川地区采集的210份圈养大熊猫粪便样品进行了蠕虫虫卵的检测,结果只检出了西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)虫卵,粪样蛔虫卵阳性率为25.71%(54/210)。在不同饲养单位以及不同月份,大熊猫西氏贝蛔虫的感染率存在显著差异(P0.05),但不同年龄和性别的大熊猫西氏贝蛔虫感染率差异不显著(P0.05)。     

大熊猫西氏贝蛔虫BsABF基因的原核表达及重组蛋白抗菌活性初步分析

本研究旨在探究大熊猫西氏贝蛔虫一个抗菌肽分子的生物学特性及其重组蛋白rBsABF在体外的抗菌活性。对西氏贝蛔虫抗菌肽BsABF基因进行克隆、原核表达及重组蛋白rBsABF的纯化,通过免疫印迹与荧光免疫组化分析重组蛋白rBsABF免疫反应性及BsABF在虫体中的分布;采用抗菌试验对重组蛋白rBsABF的抗菌活性进行了初步评价。研究结果显示,BsABF基因ORF全长276bp,编码蛋白分子大小为10.01ku,带有N端信号肽,与猪蛔虫同源基因序列相似性为94%,主要分布于虫体体壁、肠道与虫卵,重组蛋白rBsABF具有良好的免疫反应性。抗菌试验结果显示该重组蛋白对大熊猫源粪肠球菌及大肠杆菌具有一定的抗菌活性。首次鉴定了大熊猫西氏贝蛔虫BsABF基因,抑菌试验表明重组蛋白rBsABF具有抗菌活性,为今后深入研究该蛋白的功能特性奠定了基础。     

基于线粒体ATP6基因全序列分析中国绵羊痒螨(兔亚种)的遗传多样性

为进一步了解我国绵羊痒螨(兔亚种)种群的遗传变异情况和分类情况,采用PCR技术扩增绵羊痒螨(兔亚种)虫株的线粒体ATP6基因全序列,并分析所得序列,旨在探讨中国华北、华东、华中、西北、西南地区绵羊痒螨(兔亚种)种群的遗传多样性和种群结构。本研究成功获得88条序列,长度均为672 bp,包含41个单倍型,表现出较高的遗传多样性(π=0.014 94)和单倍型多样性(Hd=0.925 81),且以种群内部的遗传变异为主(97.92%)。进一步分析发现,5个种群间遗传分化程度较弱(F_st=0.020 81),基因交流频繁(Nm=11.763 5),中性检验值(Tajima’s D=0.937 98,Fu’s Fs=0.522 06)为不显著的正值,结合错配分布曲线呈现多峰,表明我国绵羊痒螨(兔亚种)种群在进化过程中比较稳定,无种群扩张事件。从单倍型网络图和NJ树可知,中国绵羊痒螨(兔亚种)没有形成基于兔品种、温度带或地理分布的遗传结构。中国绵羊痒螨(兔亚种)种群遗传多样性高,但种群间无明显分化,未形成基于兔品种、温度带或地理分布的遗传结构。     

犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位

对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了rDi-NDPK的诊断价值。免疫印迹显示,Di-NDPK具有良好的反应原性,免疫荧光组化显示,Di-NDPK在犬恶丝虫的侧索及肠上皮细胞和肠腔中分布。间接ELISA显示,该方法的敏感性为66.7%(16/24),特异性为38.9%(14/36),其中与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应。Di-NDPK是一个分泌蛋白,但不适合作为犬恶丝虫病的诊断候选抗原。     

绵羊痒螨兔亚种MMP2基因的转录水平及其重组蛋白间接ELISA的建立

本研究旨在分析绵羊痒螨兔亚种MMP2基因（PocMMP2）的虫体转录水平,及建立针对重组PocMMP2（rPocMMP2）蛋白抗体的间接ELISA检测方法（iELISA）。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定PocMMP2在不同发育阶段虫体、饱食与饥饿虫体的转录水平,采用原核表达系统获得rPocMMP2,经方阵滴定法优化反应条件,建立rPocMMP2-iELISA,并用该方法检测成都地区有痒螨病流行病史兔场的86份兔血清。结果显示：PocMMP2在雌虫、雄虫、若虫和幼虫阶段均有表达,且在饥饿虫体的转录水平显著高于饱食虫体（P<0.05）;rPocMMP2约72 ku,主要存在于包涵体中;rPocMMP2-iELISA临界值为0.223,敏感性和特异性分别为86.0%和83.3%,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.876,批内与批间重复性变异系数均小于10.00%;该方法的临床检测呈现74.42%的血清阳性检出率（64/86）,高于病原学检出率（10.47%,9/86）。PocMMP2可能参与了绵羊痒螨兔亚种发育和入侵宿主过程,且所建立的rPocMMP2-iELISA有良好的敏感性、特异性和较高的重复性,可用于兔痒螨病的血清抗体检测。     

绵阳地区山羊粪便中捻转血矛线虫的分子鉴定

为鉴定绵阳地区山羊粪便中疑似血矛属线虫虫卵的虫种,本研究提取绵阳地区三个县山羊粪便中疑似血矛属线虫的虫卵DNA 60份,采用PCR技术扩增其核糖体第二内转录间隔区(rDNA ITS-2)基因序列,并与GenBank上公布的捻转血矛线虫同源序列进行比较分析。结果显示:60份疑似血矛属线虫的虫卵DNA样品均得到191bp的ITS-2片段;60条ITS-2序列共形成15条不同的序列,含有17个单变异位点,与GenBank中多株捻转血矛线虫的同源性达95.8%~100%;ML系统发育树显示,本研究得到的15种类型ITS-2序列与已报道的捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)聚类形成一个分支。综上可得,60份来自山羊的血矛属线虫均为捻转血矛线虫。     

紫茎泽兰透皮剂的制备工艺优化及其临床杀螨效果观察

以紫茎泽兰杀螨活性主成分紫茎泽兰素A(9-羰基-10,11-去氢泽兰酮,euptox A)提取率为考查指标,对影响提取率的乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数等因素在单因素试验的基础上进行正交试验优选,确定紫茎泽兰乙醇最佳提取工艺为:加20倍量(体积质量比)的95%乙醇,回流提取3次,每次1 h。将以最佳提取工艺条件提取的紫茎泽兰乙醇提取液制成加或不加氮酮的杀螨透皮剂,进行家兔皮肤的急性毒性试验和刺激性试验。结果表明,家兔完整皮肤和破损皮肤在给药72 h后没有出现急性毒性反应和刺激性。另开展临床杀螨治疗效果试验,将30只痒螨兔和26只疥螨兔分别分成6组,A、B、C、D组分别以加氮酮紫茎泽兰生药含量1.0 g·mL^-1、0.5 g·mL^-1和不加氮酮生药含量为1.0 g·mL^-1、0.5 g·mL^-1的杀螨液涂擦处理,E组为阳性对照组,注射伊维菌素0.2 mg,F组为空白对照组,涂擦0.9%生理盐水。试验结果表明,不论痒螨组还是疥螨组,杀螨效果最好的都是加氮酮高剂量组(A组)。     

绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子重组蛋白对兔外周血单个核细胞Th1/Th2型和Th17/Treg型特征因子表达的影响

为了初步探讨绵羊痒螨巨噬细胞迁移抑制因子（PoMIF）对健康新西兰兔外周血单个核细胞（PBMC）中Th1/Th2和Th17/Treg细胞平衡的变化。采用RT-PCR从绵羊痒螨总RNA中扩增得到MIF全长基因，经原核表达、纯化重组PoMIF（rPoMIF）蛋白，并分析其氧化还原酶和互变异构酶活性。筛选与健康新西兰兔PBMC孵育的最佳rPoMIF浓度，且用最佳浓度rPoMIF（0.2 μg·mL^-1）与PBMC共同孵育0、1、6、12、24、36 h后收集细胞，用荧光定量PCR检测其Th1/Th2/Th17/Treg细胞相对应的特征性转录因子T-bet/GATA-3/RORc/Foxp3和特征性细胞因子IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-10 mRNA表达变化。结果表明：PoMIF全长363 bp，rPoMIF大小为32 ku（含pET32a标签蛋白19 ku），且具有互变异构酶活性；rPoMIF刺激后PBMC中Th1细胞的T-bet和IFN-γ先下降后上升，Th2细胞的GATA-3和IL-4均呈下降趋势，且T-bet/GATA-3和IFN-γ/IL-4比值在12、24和36 h均升高；Th17细胞的RORc和IL-17A在各时间点下降，而Treg细胞的Foxp3和IL-10在各时间点升高，且RORc/Foxp3和IL-17A/IL-10比值在各时间点均变低。rPoMIF可造成家兔外周血单个核细胞的Th1/Th2和Th17/Treg平衡分别向Th1和Treg偏移。     

豆状带绦虫六钩蚴Tp-dUTPase基因的表达及血清学诊断效果

采用PCR方法从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-dUTPase基因编码区,构建了pET32a-Tp-dUTPase原核表达载体,以重组蛋白dUTPase作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法对226份兔血清进行了检测。结果显示,Tp-dUTPase基因编码区长447bp,编码148个氨基酸,表达的重组蛋白相对分子质量为36 200,该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白Tp-dUTPase作为包被抗原建立的Dot-ELISA诊断方法显示有较高的特异性（85.7%~92.9%）和敏感性（86.4%~88.0%）,与其他种类兔寄生虫病阳性血清有较低的交叉反应。结果表明,纯化的Tp-dUTPase重组蛋白可作为兔豆状囊尾蚴病的诊断抗原。