肉牛呼吸道皮特不动杆菌的生物学特性分析

为探究分离自四川南充、宜宾和什邡3个地区肉牛呼吸道的皮特不动杆菌之间生物学特性的差异,本实验对5株皮特不动杆菌分别进行了细菌染色、培养特性、生化试验、16S rDNA和gyrB基因序列聚类分析以及MLST分型等研究。结果显示,5株分离自肉牛呼吸道皮特不动杆菌的菌体形态和不同培养基上的菌落形态均相似;5株菌的生化特性并非完全一致,主要表现在ZZCSF1807-9的枸橼酸盐、精氨酸双水解试验为阳性,丙二酸盐为阴性,与其余4株菌相反;16S rDNA系统进化树显示,5株菌均聚集在同一分支,而gyrB基因系统进化树显示,ZZCSF1807-9与其余4株菌未在同一分支,存在进化距离;MLST分型结果显示,ZZCSF1807-9为ST214型,而另4株菌均与ST321型最为接近。上述结果表明,来源于呼吸道疾病肉牛的5株皮特不动杆菌在生化特性表型和gyrB基因,以及MLST型上存在一定差异,发生这些差异是否与各菌株的环境适应或因毒力变化有关尚有待进一步研究。     

色杆菌灭活疫苗的制备与免疫效果评价

为防控小熊猫色杆菌病，按细菌灭活疫苗制备程序将海峡(福州)大熊猫研究交流中心2008年、2020年分离的2株色杆菌CV08毒株和CV20毒株经条件优化后灭活，分别制备成灭活菌液与铝胶佐剂联用制备成灭活疫苗。以BALB/c小鼠为试验动物，建立色杆菌感染模型，用2种方式接种CV20毒株灭活疫苗，比较2种接种途径效果。进一步设计2株色杆菌半数致死量(LD₅₀)梯度对二免后小鼠进行攻毒保护试验，同时进行交叉攻毒保护试验。结果表明：CV20毒株灭活疫苗肌肉注射效果优于皮下注射。CV08毒株和CV20毒株对每只小鼠的LD₅₀分别为3.2×10⁸、5×10⁷CFU。色杆菌CV08毒株灭活疫苗对不同LD₅₀攻毒小鼠的保护率为83%、 70%、60%;色杆菌CV20毒株灭活疫苗对不同LD₅₀攻毒小鼠的保护率为75%、70%、10%。试验制备的CV08、CV20毒株疫苗含菌量均为4×10⁹ CFU·mL^-1,安全检验合格，能对自身菌...     

猪红斑丹毒丝菌制苗用菌株的筛选

为筛选出致病力强、抗原性优良、遗传性状相对纯一稳定的猪红斑丹毒丝菌制苗用菌株,对42株临床分离的猪红斑丹毒丝菌进行筛选,通过小鼠致死性试验确定4株受试菌株,编号为AEr9、AEr21、AEr31和AEr32。采用改良寇氏法测定受试菌株的半数致死量(LD₅₀),通过微量平板凝集和琼脂扩散试验测定反应原性,基于小鼠免疫攻毒试验测定免疫原性,并通过连续传代培养,分别对第10、20、30代受试菌株进行LD₅₀、沉淀抗体滴度和免疫保护率检测,以确定稳定性。结果显示,AEr9、AEr21、AEr31、AEr32的LD₅₀分别为845、50.3、35.5和10.1 cfu·mL^-1,微量平板凝集试验和琼脂扩散试验进一步筛选出反应原性高的菌株AEr21和AEr31。灭活全菌体免疫小鼠,均产生免疫保护力,以AEr31免疫保护力最好。细菌传10代后,两株菌毒力均出现致病力减弱的情况,第10、20、30代菌株致病力趋向于稳定,AEr21引起的兔抗猪丹毒血清沉淀抗体滴度水平更稳定。说明菌株AEr21、AEr31具备毒力强、抗原性好、遗传稳定的特性,可作为猪红斑丹毒丝菌制灭活苗用的候选菌株。     

基于细菌全基因组的大口黑鲈源维氏气单胞菌AV040株致病性与耐药性解析

2021年7月安徽某养殖场的大口黑鲈(Micropterus salmoides)苗在下塘期发生了爆发性死亡。在排除寄生虫和病毒感染后，从患鱼脾脏和肾脏分离到多株细菌，经鉴定，血平板单菌落β-溶血试验和回归感染筛选出一株致病力较强的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)AV040株。AV040全基因组测序(GenBank ID:CP095841)显示，253个编码序列为毒力基因，其中编码的黏附(adherence)分子156个、分泌系统(secretion system)85个、毒素(toxin)12个。腹腔注射AV040株对大口黑鲈(约10 g)和昆明白小鼠(约20 g)的半数致死浓度(median lethal dose, LD₅₀)分别为6.53×10⁶ CFU·g^-1和2.97×10⁷ CFU·g^-1;受染大口黑鲈表现为胸鳍、腹鳍、肛门、肝胰腺、脾脏和幽门垂出血；受染小鼠表现为蜷缩、眯眼和颤抖，肝脏和肠道出血。AV040全基因组中有5个耐药基因，并采用K-B...     

10种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内活性评价

为筛选出对苹果树腐烂病防治高效的生物源杀菌剂,采用菌丝生长速率法、分生孢子萌发法和离体枝条接种法,测定了10种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果及其在苹果离体枝条上的保护作用。结果表明,10种供试生物源药剂对腐烂病菌均有一定的抑制效果,除3%中生菌素WP外,其他9种药剂对分生孢子萌发的抑制效果均优于对菌丝生长的抑制效果。其中,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP和复合微生物菌剂3种药剂的室内毒力最强,对菌丝生长和分生孢子萌发的EC₅₀分别为0.69、0.89、1.88、0.19、0.039μg·mL^-1和0.064μg·mL^-1。其次为0.5%氨基寡糖素AS、3%中生菌素WP、5%香芹酚AS、0.5%小檗碱AS和0.4%蛇床子素SL 5种药剂,对菌丝生长的EC₅₀为26.06～290.7μg·mL^-1,分生孢子萌发的EC₅₀为8.29～136.0μg·mL^-1。而0.3%苦参碱EC和2%农抗120AS对菌丝生长的EC₅₀均>2 000μg·mL^-1,显著>其他几种药剂,室内毒力最差。离体枝条保护试验结果表明,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP、0.5%氨基寡糖素AS和复合微生物菌剂对离体枝条保护作用最强,其室内防效均>85%,而0.3%苦参碱EC和2%农抗120AS保护作用最差,其室内防效与其他药剂之间存在显著差异,这与室内毒力测定结果相一致。综上所述,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP、复合微生物菌剂和0.5%氨基寡糖素AS 4种药剂可作为防治苹果树腐烂病的替代生物源杀菌剂。     

四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析

猪伪狂犬病毒(PRV)的流行对中国养猪业造成巨大损失,而2011年后许多已免疫PRV疫苗的猪场频繁出现gE抗体转为阳性现象,感染猪出现PRV的临床症状,并出现所谓的“流产风暴”,学者们怀疑PRV的重新流行与病毒毒力增强和基因变异有关。为了解PRV变异情况,从各地疑似PRV阳性病料中,通过PK-15细胞分离出4个毒株,对毒株传代培养,进行TCID₅₀与LD₅₀测定,对主要毒力基因gB、gC、gE和TK进行扩增测序后分析,确定该4株病毒为PRV株,分别命名为FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株,滴度分别为10^-6.63、10^-7.08、10^-8.10、10^-7.18 TCID_50s·0.1mL^-1,对Balb/c小鼠的LD₅₀分别为10^2.17、10^2.72、10^3.44、10^3.51 TCID_50s,可见FJ01株的毒力最强。对4个毒株的毒力基因与其他PRV毒株进行同源性比对并建立进化树,FJ01株、FJ03株、MS2018株与中国近几年流行的变异毒株如HNX株、HNB株、JS-2012株等在一个大进化分支上,亲缘性较近,而与疫苗株Bartha-K61、SA215等,国际经典毒株Becker、Kaplan等亲缘性较远,变异较大。YK株与国际毒株亲缘性更近,其原因有待进一步探索。     

棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2016年4月四川雅安一棘胸蛙(Quasipaa spinosa)养殖场暴发一种临床特征表现为白内障、体表溃疡和神经症状的传染病。为明确此次流行病病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌理化特性与16S rDNA基因序列分析。结果从患病蛙肝、脾、肾中分离到一株G^-短杆菌(CM160701);将其腹腔注射感染健康棘胸蛙表现出与自然发病蛙相似症状。该菌的LD₅₀为1.19×10⁶ cfu·只^-1;通过理化特性与16S rDNA基因序列分析鉴定分离菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica);其对氟苯尼考敏感,对恩诺沙星、多西环素、阿莫西林等多种药物耐受。病理组织学观察发现,其感染对全身多组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,尤以脑、肝、脾、心和肾损伤严重。该研究证实了脑膜炎败血伊丽莎白菌是本次疫情的病因,其感染引起棘胸蛙全身性损伤导致多组织器官功能障碍而死亡。     

绣球菌对肿瘤细胞的抑制作用

采用体外细胞实验考察绣球菌水提物对4种肿瘤细胞的抑制作用。绣球菌水提物在0~6.4 mg·mL^-1浓度下分别作用24和48 h对4种肿瘤细胞增殖抑制作用具有一定的组织选择性。结果显示:绣球菌水提物浓度为0.4 mg·mL^-1时,对人胃癌SGC-7901的抑制作用强于人肺癌A549细胞;6.4 mg·mL^-1绣球菌水提物对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用,由强到弱依次表现为人肺癌A549>人胃癌SGC-7901>人胰腺癌PANC-1>人肝癌HepG2。     

猪链球菌2型制苗用菌株的筛选

为筛选出致病力强、抗原性优良、遗传性状相对稳定的猪链球菌2型(Streptococcus suis 2,SS2)制苗用菌株。以6株临床分离SS2强毒株为受试菌株(编号为HF1、XC1、HF2、HF3、BZ1、BB1),通过改良寇氏法测定菌株半数致死量(LD₅₀),利用ELISA检测新西兰大白兔和昆明鼠血清的抗体效价测定反应原性,昆明鼠及斑马鱼免疫攻毒试验测定免疫原性,同时连续传代培养受试菌株,检测第10代、20代和30代菌株的半数致死量(LD₅₀)、血清抗体效价和免疫保护率。结果显示,BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2和HF3对昆明鼠的LD₅₀分别为3.72×10⁹、3.31×10⁸、1.58×10⁹、1.00×10⁹、5.01×10⁸和3.24×10⁸ CFU·mL^-1;对斑马鱼的LD₅₀分别为3.31×10³、0.93×10²、6.03×10³、3.39×10⁴、0.62×10²和2.34×10³ CFU·mL^-1。ELISA抗体效价测定和免疫攻毒试验结果显示,HF2、HF3和BZ1的反应原性和免疫原性均优于HF1、XC1、BB1。HF2、HF3、BZ1在第10代均出现致病力减弱,其中BZ1传至20代、30代时仍呈现下降趋势,而HF2和HF3则趋于稳定。灭活全菌体HF2、HF3的血清抗体效价均由第10代1∶51 200下降至第30代的1∶12 800,而BZ1则由1∶12 800下降至1∶6 400。HF2、HF3、BZ1对昆明鼠和斑马鱼的免疫保护率分别为100%~80%、80%~60%、80%~40%和66.7%~60%、80%~60%、60%~53.3%。结果表明,HF2和HF3具备毒力强、抗原性好、遗传稳定的特性,可作为SS2制苗用菌株。     

绣球菌水提物的免疫促进作用

本文系统研究了绣球菌水提物对小鼠非特异性免疫功能及细胞免疫功能的影响。研究发现,绣球菌水提物300和600 mg·kg^-1剂量灌胃给药15 d,对环磷酰胺诱导小鼠免疫下降具有一定的保护作用,可增强巨噬细胞的吞噬功能;体外试验结果表明,绣球菌水提物0.4和0.8 mg·mL^-1单独或联合ConA(5 μg·mL^-1)用药均具有明显的促淋巴细胞增殖作用。上述结果表明,绣球菌水提物具有促进免疫功能的药效学作用。     

隐绿原酸对H9N2-AIV致小鼠肺损伤的免疫调节和抗氧化效果

为探讨隐绿原酸(4-CQA)对感染H9N2亚型禽流感(H9N2-AIV)病毒的小鼠造成肺损伤的修复作用,将90只6～8周龄健康昆明系小鼠随机分为病毒(H9N2)感染组、H9N2+4-CQA组、空白对照组、4-CQA对照组,用H9N2-AIV滴鼻复制小鼠肺损伤模型并灌胃4-CQA干预.观察各组小鼠肺组织病理学变化;测定肺...     

猪链球菌4型转录调控因子GalR的生物学特性

【目的】 研究分析猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4,SS4）强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因的缺失对细菌生物学特性的影响,为进一步研究GalR对半乳糖代谢途径的调控及其致病机理提供理论依据。【方法】 利用同源重组双交换的方法构建了SS4强毒株SH1510 转录调控因子GalR基因缺失株SH1510ΔGalR,通过GalR基因内部扩增引物I1/I2进行缺失株初步筛选,进一步通过PCR和Western blotting鉴定缺失株SH1510ΔGalR。对亲本株SH1510和缺失株SH1510ΔGalR进行革兰氏染色以比较形态差异;配置基础培养基,分别加入葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖后培养细菌,绘制细菌生长曲线,比较细菌对不同糖的利用率;将亲本株和缺失株的菌液浓度分别调整为2.5×10 ⁹、5×10 ⁸、1×10 ⁸、2×10 ⁷ CFU/mL,对BALB/c小鼠进行腹腔注射以观察小鼠致死率并使用Reed-Muench法计算菌株LD₅₀。将浓度为2×10 ⁷CFU/mL的亲本株和缺失株1﹕1等体积混合后腹腔注射BALB/c小鼠,24 h后取脑、脾、血在氯霉素抗性和无抗性THB平板上进行细菌计数,比较细菌在小鼠体内的定植能力;并以健康猪的全血模仿体内环境,将亲本株和缺失株分别加入含有SS4抗血清的健康猪全血中,37℃孵育2 h进行平板计数,比较细菌在全血中的存活能力。【结果】 使用内部检测引物I1/I2做PCR,缺失株SH1510ΔGalR检测为阴性,进一步使用引物C1/C2、O1/C2、O2/C1、O1/O2鉴定缺失株SH1510ΔGalR,分别扩增出1 056、2 121、2 094、3 147 bp的片段,结果和预期相符。Western blotting 鉴定结果表明亲本株SH1510可与粗制GalR多抗兔血清发生特异性结合,在37 kD处出现单一条带,但缺失株SH1510ΔGalR没有条带出现。PCR和Western blotting鉴定结果均表明缺失株SH1510ΔGalR已构建成功。亲本株和缺失株经革兰氏染色,光学显微镜下观察可见亲本株和缺失株均呈链状排列,长度相似,形态无显著差异。在葡萄糖和蔗糖作为唯一糖原的生长条件下,亲本株和缺失株的生长情况相仿,而当糖原为D-半乳糖时,缺失株的生长速率和OD₆₀₀值明显低于亲本株。另外,从最高OD₆₀₀值可以看出,猪链球菌SH1510对糖的利用率为葡萄糖>蔗糖>D-半乳糖。 小鼠致病性试验中,亲本株和缺失株的LD₅₀分别为1×10 ⁸CFU和1.62×10 ⁸CFU,缺失株对小鼠的致病性下降了1.62倍。体内竞争感染试验结果显示,缺失株在小鼠的脑、脾、血液中的细菌分离数均远低于亲本株,差异极显著（P＜0.01）。全血存活试验表示,亲本株的存活率为35.2%,缺失株的存活率为27.3%,缺失株SH1510ΔGalR比亲本株SH1510在全血中的存活率显著下降（P＜0.05）。【结论】 GalR 基因可促进猪链球菌4型对半乳糖的利用,同时对SH1510的毒力有直接或间接的调控作用。     

H9N2亚型猪流感病毒的分离、鉴定及其对小鼠的致病性研究

[目的]确定分离的H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性。[方法]利用此株猪流感病毒对SPF级6～8周龄、雌性BALB/c小鼠进行滴鼻感染,观察小鼠临床症状,感染后第2、6和14天分别剖杀小鼠,摘取各主要脏器后对其进行病理学检查。[结果]感染小鼠出现精神不振、体重下降、引起以弥漫性肺泡损伤为主的临床症状和病理变化。[结论]该研究成功进行了H9N2猪流感病毒对BALB/c小鼠的感染,可以作为感染模型进行H9N2猪流感病毒的发病机制、疫苗评价、药物筛选等研究。     

猪链球菌2型灭活疫苗对小鼠的免疫效果评价

在前期筛选出2株毒力强、抗原性好、遗传稳定的猪链球菌2型(SS2)疫苗菌株(HF2、HF3株)并分别制成灭活疫苗(采用ISA 201 VG矿物油佐剂)的基础上,进一步与SS2商品化灭活疫苗(HA9801株,铝胶佐剂)同步免疫小鼠,利用间接ELISA、流式细胞术、免疫攻毒试验、细菌定植试验和病理组织学观察等方法测定小鼠血清中IgG抗体效价,细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1),外周血中CD4⁺/CD3⁺、CD8⁺/CD3⁺ T细胞亚群含量,攻毒保护率,组织荷菌数和病理组织变化等指标。结果显示,二免7 d后,HF2、HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组的血清IgG抗体效价分别为1:25 600、1:12 800、1:25 600;HF2灭活疫苗组的IL-4、IL-10含量显著高于HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组,IFN-γ、TNF-β含量显著高于HF3灭活疫苗组,但MCP-1含量显著低于HF3灭活疫苗组;HF2和HF3灭活疫苗组的CD4⁺/CD3⁺ T细胞比率均显著低于HA9801商品化灭活疫苗组,但CD8⁺/CD3⁺ T细胞比率差异不显著;HF2、HF3灭活疫苗和HA9801商品化灭活疫苗对小鼠的攻毒保护率均为100%;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、脾脏组织荷菌数显著低于HF3灭活疫苗组;HF2灭活疫苗组小鼠的肺、肾、脾脏病理变化较HF3灭活疫苗组和HA9801商品化灭活疫苗组轻微。综合结果表明,由SS2(HF2株)制备的ISA 201 VG佐剂灭活疫苗免疫小鼠后不仅可产生较强的免疫应答,还可完全抵抗强毒株的攻击。     

杂交鲟出血病病原的分离鉴定与组织病理学观察

为确定重庆彭水地区杂交鲟患病死亡的原因,从患病鲟肝中分离到一株优势菌CQST-2,对其进行形态学观察、人工感染、理化特性测定、分子生物学鉴定、毒力基因检测与药敏试验,进一步对患病组织进行病理观察。结果表明,该菌为革兰氏阴性短杆菌,感染健康杂交鲟可复现与自然患病鱼类似病症;16S rRNA、gyrB、rpoB和cpn60基因与维氏气单胞菌的同源性分别达99.7%、99.9%、99.4%和99.8%,构建的系统发育树与维氏气单胞菌聚为一支;在水温为(22±1)℃时,对杂交鲟的半数致死量LD₅₀为2.0×10⁵ CFU·g^-1;毒力基因检测发现,该菌携带ompA、act、aer、hlyA和alt等5种基因;病理组织观察发现,患病鱼肝细胞结构模糊,肝血窦扩张充血,肠绒毛坏死脱落,肌肉层充血,鳃小片弯曲,上皮细胞增生。药敏试验表明,菌株CQST-2对氧氟沙星、氟苯尼考等18种药物高度敏感,对麦迪霉素、吉他霉素、青霉素等9种抗菌药物耐药。研究结果表明,菌株CQST-2是杂交鲟的致病菌,该菌对杂交鲟具有较强的致病性,可引起多个器官发生病变。     

除草活性菌株HL-1产孢发酵条件研究

以分离自青海患病刺儿菜中具有除草活性的植物内生真菌HL-1菌株为研究对象,通过单因素试验筛选最适合该菌株生长的碳氮源、固态发酵基质、接种量和固-液发酵条件。结果表明:在供试的材料中最适碳源是葡萄糖,氮源是酵母浸膏;该菌株在PDA培养基中的最大产孢量是5.79×10⁸ CFU·mL^-1;而在最适碳源和最适氮源混合培养基中,它的最大产孢量是 4.81×10⁹ CFU·mL^-1。菜籽饼为HL-1在供试材料中产孢最大的培养基质;在体积分数为40%接种量下,它的产孢量最大。通过正交优化试验发现该菌株在培养温度27.5 ℃,培养基质含水量37%,发酵时间8 d条件下,产孢量最大。