2株H9N2亚型禽流感病毒的致病性

为了解从我国洞庭湖地区鸡和鸭中分离的H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,本研究选用具有代表性的2株病毒对SPF鸡及BALB/c小鼠进行致病性试验。结果显示:2株毒株均能使鸡感染并排毒,并且使同居鸡感染排毒,但不引起鸡明显的临床症状及死亡;2株毒株感染SPF鸡后能在鸡喉分离到高滴度病毒,明显高于泄殖腔,且排毒期主要集中于第1~7天;从感染鸡脏器中病毒复制情况看,供试的2株病毒均未在脑等组织脏器中复制,而2株病毒感染BALB/c小鼠后,在小鼠脏器中复制情况却不一致,A/CK/HuN/S4591/2011(H9N2)毒株在小鼠鼻甲及肺脏中均能检测到病毒,但是A/DK/HuN/S4111/2011(H9N2)毒株仅在小鼠鼻甲中检测到较高滴度的病毒。     

肌肽对H9N2亚型猪流感病毒致小鼠肺病理损伤的影响

探讨肌肽(carnosine)对人工感染H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)小鼠肺部组织病理损伤变化的影响。选用6~8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠150只,随机分为对照组、感染组和肌肽干预组,每组50只,分别鼻腔接种正常鸡胚尿囊液、含H9N2-SIV的鸡胚尿囊液和肌肽+含H9N2-SIV的鸡胚尿囊液。试验第2、4、6、8和14天,每组分别处死8只小鼠,观察肺组织的病理变化、测定肺系数及肺湿/干质量比。结果显示,肌肽可减轻H9N2-SIV造成的小鼠临床症状,降低死亡率;肌肽干预组在试验第6天和第8天明显降低肺组织肺湿/干质量比(P0.05);在试验第4、6、8天明显降低肺系数值(P0.05),并减轻肺部淤血、出血、水肿、炎性细胞浸润等肺部病理变化。可见:肌肽可降低肺组织肺湿/干质量比及肺系数值并减轻肺部病理变化,从而减轻小鼠肺部损伤的程度、降低死亡率。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

不同剂量复合维生素对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠有效保护效果研究

为验证维生素A、维生素C、维生素D和维生素E复合维生素对小鼠感染H9N2亚型禽流感病毒是否有保护效果,采用A/Chicken/HB/4/2008(H9N2)鼻腔接种6周龄BALB/c小鼠,复合维生素的剂量设高中低3个层次。结果表明,每天给予800 IU维生素A、25 mg维生素C、12 IU维生素D和3.2 IU维生素E的高剂量复合维生素组小鼠感染H9N2亚型禽流感病毒后精神状态、体温和采食量的维持明显好于其他组,尤其在体重方面,感染后体重仅降低7%,低于其他组22%～30%。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

肌肽对H9N2亚型猪流感病毒致小鼠肺部组织SOD、MDA、iNOS和NO的影响

探讨肌肽(carnosine)对H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)致小鼠肺部损伤时肺组织的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影响。选用6~8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠150只,随机分为对照组、模型组和肌肽组,每组50只,分别给予正常鸡胚尿囊液、H9N2-SIV和肌肽+H9N2-SIV。试验第2、4、6、8和14天分别观察小鼠的临床表现,统计死亡率,每个观测时间每组处死8只小鼠,检测肺组织匀浆中SOD、MDA、iNOS和NO。肌肽可减轻H9N2-SIV造成的小鼠临床症状,降低死亡率,在试验第6、8天显著提高肺组织的SOD活性(P0.05),显著降低MDA含量、iNOS活性和NO含量(P0.05)。肌肽通过提高肺部SOD活性,降低iNOS活性、MDA含量和NO含量,抑制由H9N2-SIV造成的自由基和脂质过氧化反应,改善肺组织的水肿程度,减轻小鼠肺损伤的程度、降低死亡率。     

环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响

旨在分析环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响。选用120只6~8周龄,雄性SPF BALB/c小鼠,随机分为4组:无感染常温组(PBS处理,(20±2)℃)、无感染低温组(PBS处理,(10±2)℃)、H9N2病毒感染常温组(H9N2处理,(20±2)℃)、H9N2病毒感染低温组(H9N2处理,(10±2)℃)。在感染后观察感染小鼠发病14 d内的临床症状、存活率,肺脏病变程度、肺部细胞因子含量的动态变化以及肺脏病毒载量。结果表明:1)与H9N2病毒感染常温组小鼠相比,环境低温处理的H9N2病毒感染小鼠临床症状明显加重,其中体重明显降低,但差异不显著(P>0.05),存活率由95%降为67%,肺水肿程度和肺组织病变程度更加严重;2)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺脏TNF-a和IL-1β含量无显著差异,但均显著高于2个无感染组(P<0.01);3)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺组织病毒载量显著增加(P<0.01)。综上,环境低温明显增加了H9N2亚型流感病毒对小鼠的致病性,为进一步揭示环境低温与流感病毒感染之间的关系,以及采取有效的预防措施提供数据基础。     

H9N2亚型猪源性流感病毒对C57BL/6小鼠致病性的研究

目的探讨A/swine/heBei/012/2008/(H9N2)猪源性流感病毒(H9N2-SIV)对C57BL/6近交系小鼠的致病特征,为进一步利用该品系瞬时电位受体M2基因(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)敲除小鼠模型研究H9N2-SIV致血管内皮细胞损伤的作用机制奠定基础。方法经鼻腔接种途径感染C57BL/6小鼠,观测临床症状、采食量及体质量变化、死亡率、组织病理学变化;测定病毒在组织内的复制滴度及半数致死量(50%lethal dose,LD50)。结果感染后2~8d,感染小鼠精神高度沉郁,采食量降低、体质量严重下降并出现严重的呼吸困难。5~8d内60%小鼠死亡;肺脏严重水肿、出血;病理组织学变化以肺严重水肿、出血、坏死和炎性细胞渗出为主;病毒分离显示包括脑在内的所有肺外器官均分离出H9N2病毒,但肺组织病毒滴度最高,第3天和第7天分别为5.2log2和8.1log2;该毒株的LD50为10-2.5/0.1mL。结论H9N2-SIV在未经预先适应的情况下能够引起C57BL/6小鼠以肺部损伤为主的致死性全身感染,证实以C57BL/6小鼠为基础构建TRPM2基因敲除模型可作为进一步研究H9N2-SIV致血管内皮细胞损伤作用机制的动物模型。     

H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/21/01株反向基因操作系统的建立

H9N2亚型禽流感病毒自1994年在中国大陆首次分离以来,不仅在家禽中广泛流行,而且也可以感染哺乳动物和人.由于H9N2亚型禽流感病毒是低致病性的,更增加了其感染人并在人群中存在下去的可能性,因此研究其感染哺乳动物的分子机制具有重要的意义.本研究建立了A/Chicken/Guangdong/21/01(简称:CK/GD/21)病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过转染293T细胞成功拯救了该病毒R-GD/21.R-GD/21在对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒一致的生物学特性.CK/GD/21反向基因操作系统的成功建立,为今后通过基因替换、定点突变技术确定H9N2亚型禽流感病毒感染哺乳动物的分子机制奠定了基础.     

猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10~(-6)、1×10~(-6)和1×10~(-5)。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Western blot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56 ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIV NP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

[目的]了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础.[方法]运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05( H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析.[结果]扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151 bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717 aa.经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%~ 100.0%和98.5%~99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近.[结论]广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题.     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

不同H9N2亚型鸭流感病毒NS1基因克隆和功能进化分析

[目的]为进一步研究NS1蛋白在流感病毒跨宿主传播中的作用机制奠定基础。[方法]采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,从广东不同地区的12~20日龄正常番鸭群中分离鉴定出多株H9亚型水禽禽流感病毒株,对其中4株分离于正常番鸭的禽流感病毒毒株A/duck/ZQ/303/2007（H9N2）（简称A3）、A/duck/FJ/301/2007（H9N2）（简称C1）、A/duck/NH/306/2007（H9N2）（简称D6）和A/duck/SS/402/2007（简称E2）和1株来源于病死番鸭的H9N2亚型鸭流感病毒A/duck/ZC/1/2007（H9N2）（简称L1）的NS1基因进行克隆测序,并与GenBank中收录的其他NS1序列进行比较,分析NS1基因的进化关系。[结果]4株分离于不同地区正常番鸭群的流感病毒株NS1基因与GenBank中注册的H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为99%~100%,氨基酸同源性为95%~100%。而分离于病死鸭的流感病毒株与H9N2 AIVNS1基因核苷酸同源性为94%~97%,氨基酸同源性为93%~99%。遗传进化结果表明：分离于正常鸭群的4株流感病毒NS1基因独成一分支,而L1株与2003年的鸡源AY66473株亲缘关系最近。DNAstar软件分析表明：与L1、AF523514（鸭源）、AY664743（鸡源）、EF155262.1（鹌鹑）相比,A3、C1、D6、E2 4株正常鸭H9N2 AIV毒株的NS1基因核苷酸序列在21（R→Q）7、07、1（KE→EG）8、6（A→S）1、24（V→M）、225（S→N）位点处发生改变,NS1基因的双股RNA依赖性蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）结合区（1~100位氨基酸）39、70、71和86位氨基酸发生变化,导致NS1蛋白潜在的抗原决定簇及其特定区域位于蛋白表面的可能性发生明显变化。[结论]NS1蛋白PKR结合区氨基酸序列变化与病毒的致病性有一定关系。     

中药复方制剂抗猪流感病毒作用的研究

[目的]探讨中药复方制剂(金银花、连翘、薄荷、牛蒡子、桔梗、甘草、淡竹叶、淡豆豉)对感染猪流感病毒小鼠的保护作用。[方法]猪流感病毒感染小鼠4 h后给药,以死亡率、平均存活时间、肺指数、肺指数抑制率、血凝滴度、脾脏指数、胸腺指数为评价指标,观察中药复方制剂在小鼠体内的抗流感病毒作用。[结果]中药复方制剂能降低流感病毒感染小鼠的死亡率(P0.01),延长小鼠的存活时间(P0.01),降低肺指数(P0.01),降低血凝滴度(P0.01),增加胸腺指数(P0.01)。[结论]该中药复方制剂具有良好的抗猪流感病毒作用。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

2株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传性分析（摘要）

[目的]了解2株H9N2分离毒株与其他参考毒株的全基因组遗传变异关系。[方法]采用RT-PCR技术扩增了2株H9N2亚型禽流感病毒分离株8个基因片段的全基因序列,并对所得序列与6个参考毒株进行了同源性比较及遗传进化树分析。[结果]2个毒株与6个参考毒株全基因组同源性在91.1%～95.4%,PG08与C/BJ/1/94的全基因序列的核苷酸同源性最高为91.3%;而ZD06与D/HK/Y280/97最高为92.3%。2个分离株的HA基因裂解位点均为PARSSR/GLF,所以均为H9N2低致病力禽流感病毒。[结论]ZD06株与C/Pak/2/99的亲缘关系最近,属欧亚种系;PG08株与其他毒株亲缘关系稍远,它可能是不同亚支基因重排的产物。     

流感病毒快速诊断试剂中HA抗原热稳定性的研究

[目的]筛选流感病毒HA抗原保护剂。[方法]将H3N2和H1N1亚型流感病毒分别加入A～F组中,在37℃下进行加速试验,并通过血凝试验测定HA滴度。[结果]在28 d A组(添加PBS缓冲液)中H3N2和H1N1亚型流感病毒的HA抗原血凝滴度分别为20和32。F组(添加BSA、岩藻糖、Proclin 300、Triton 100)HA抗原的热稳定性最好,在28 d H3N2和H1N1亚型流感病毒HA抗原血凝滴度分别为48和96。[结论]F组成分对流感病毒HA抗原的保护作用最好,可作为保护剂候选配方。     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。