禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。     

单抗介导的血凝试验对H9N2亚型禽流感病毒的研究

利用4株鼠源抗H9N2禽流感病毒血凝素单克隆抗体与标准H9N2禽流感多克隆抗体,通过血液凝集抑制试验(Haemoglutination inhibition test,HI)分别对25株H9N2禽流感病毒进行了检测,发现4株单克隆抗体均对其中的23株H9N2禽流感病毒反应,其最高HI效价分别为:A单抗12log2,B单抗12log2,C单抗12log2,D单抗12log2;最低分别为:A单抗3log2,B单抗9log2,C单抗4log2,D单抗6log2,而对其中的2株H9N2禽流感病毒没有HI反应,其HI价均为0;然而,标准多抗对25株H9N2禽流感病毒均产生HI反应。检测结果表明2株H9N2AIV毒株血凝素蛋白出现了抗原漂变。     

不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

 【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制（HI）和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变（S→N）,导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点（S145）为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

C型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将灭活的C型FMDV背部皮下多点注射免疫BABL/c小鼠,取小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG1 500作用下融合,用有限稀释法进行亚克隆.以C型FMDV重组VP1蛋白为抗原,间接ELISA法筛选单抗.以O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒为抗原,间接ELISA法检测单抗特异性.获得2株抗C型FMDV的单抗3B3和6D5,亚型鉴定为IgG1、IgG3;腹水效价分别为1∶25 600和1∶51 200;中和效价分别为1∶1 280和1∶640;2株单抗与O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒间无交叉反应,表明这2株单抗为高特异性抗C型FMDV单抗.研究结果可为C型FMD的诊断及预防提供基础材料,也可用于病因学及免疫学研究.     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其生物学特性

以灭活的H9亚型禽流感NJ01病毒株作为抗原,按常规方法免疫BALB/c鼠,最后一次免疫后第3 d取脾细胞与SP2/0细胞进行融合,采用H I进行筛选,检出18个阳性孔,阳性率为4.69%。对其中的3个阳性值较高的孔进行3次克隆,最终获得3株单克隆细胞,分别命名为1E1、2E10和3G2。通过与新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、H5亚型禽流感病毒进行H I试验,证明1E1、2E10和3G2分泌的抗体具有特异性。经连续1个月的体外培养和两次冻存复苏仍能稳定地分泌抗H9亚型禽流感H I抗体,3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为IgG1,杂交瘤细胞的染色体数目为92~108条,平均97条。杂交瘤细胞培养上清和腹水对H9亚型禽流感病毒的H I值分别为25~28和212~214,PD50分别10-2~10-1.67和10-4~10-3.33。单克隆抗体的制备为禽流感的快速诊断、预警预报和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单抗9A4H4的鉴定

为鉴定抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体9A4H4与不同猪瘟病毒(CSFV)株的反应性,将其与猪瘟病毒石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株和前期分离获得的106株猪瘟流行毒株进行IFA验证。在此基础上,利用昆虫杆状病毒系统表达的基因1型、2型和3型代表性毒株的E2蛋白进行了Western blot验证。试验还利用含有或不含β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液对真核表达和原核表达的石门株E2蛋白进行处理,并与单抗9A4H4进行反应,初步鉴定了该单抗所识别抗原表位的类型,并利用石门株进行中和试验验证该抗体对CSFV的中和能力。间接免疫荧光试验结果表明:单抗9A4H4能与石门株、猪瘟兔化弱毒疫苗株、基因1型以及大多数的基因2.1b亚亚型、2.2、2.3基因亚型的毒株反应,与绝大多数的2.1a、2.1c、2.1g和2.1h基因亚亚型的毒株不反应,该结果与单抗和病毒E2蛋白的反应结果完全一致。Western blot结果表明:单抗9A4H4只与真核表达的非还原型石门株E2蛋白反应,与真核表达的还原型E2蛋白以及原核表达的石门E2蛋白不反应,表明该抗体识别的抗原表位为构象表位。中和试验结果表明,单抗9A4H4对CSFV石门株没有中和能力。     

H3N2亚型SIV血凝蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的单克隆抗体,为SIV的鉴别诊断奠定基础。【方法】将A/swine/Henan/1/2010(H3N2)猪流感病毒初步浓缩后,免疫6周龄的BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与瘤细胞NS0融合,采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行Western blot检验和抗原结合活性检测。【结果】经过3次有限稀释法克隆纯化,最终得到1株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株,命名为1C10,经检测其腹水抗体效价为1∶51 200。单克隆抗体亚型鉴定结果表明,1C10为IgG1亚型,轻链类型为κ链。Western blot检测结果表明,这株单克隆抗体能与H3N2特异性结合,而且能特异性识别血凝素蛋白(HA),而不与H1N1亚型猪流感病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒发生交叉反应。【结论】制备获得1株抗猪流感H3N2病毒HA蛋白的单克隆抗体,可用于猪流感病毒鉴别诊断方法的建立。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器研究(英文)

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N'-(3-二甲氨基)丙基碳化二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒(NDV)反应,检测灵敏度达到20～100个EID50。[结论]该结果为检测禽流感病毒免疫传感器的进一步深入研究奠定了基础,这为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

H5N1Re-5株和H9亚型SS株对土三黄鸡的免疫效果对比

[目的]探究H5N1Re-5株和H9亚型SS株对土三黄鸡不同的免疫效果。[方法]选用广西桂林市某种鸡场土三黄鸡180只,试验组注射禽流感H5和H9疫苗,对照组不注射疫苗,检测145日龄注射H5和H9疫苗后的抗体水平。[结果]禽流感H5疫苗145日龄注射后第170日龄抗体检测：试验1、2组分别比各自对照组的平均抗体值比较差异达0.01极显著水平;禽流感H9疫苗145日龄注射后第170日龄抗体检测：试验1、2组分别比各自对照组的平均抗体值比较差异不显著。[结论]禽流感H5疫苗145日龄注射后能显著地提高抗体水平;禽流感H9疫苗145日龄注射后不能显著地提高抗体水平。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器的研究

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N-′（3-二甲氨基）丙基碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒（NDV）反应;检测灵敏度达到20~100EID50。[结论]该研究为深入研究检测禽流感病毒的免疫传感器奠定了基础,为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

不同培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果研究

[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。