牛IgG2 Fc受体的真核表达、纯化与结晶

【目的】制备牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)蛋白并分析其结构与生物学功能,为进一步研究其免疫学功能奠定基础。【方法】PCR扩增boFcγ2R的胞外区基因片段,将其克隆至真核表达载体pMT/BiP/V5-His A构建重组pMT/BiP-boFcγ2R-His质粒,利用果蝇胚胎Drosophila Schneider 2(S2)细胞表达boFcγ2R胞外区重组蛋白,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,利用Dot-blot验证其生物学功能;采用蒸汽扩散坐滴法对目的蛋白进行结晶,对晶体进行X-ray衍射分析;利用去糖基化酶Endo Hf和PNGase F对目的蛋白进行处理,以验证其糖基化修饰与晶体无衍射之间是否存在因果关系。【结果】PCR扩增获得了663 bp的boFcγ2R基因胞外区片段。成功构建了pMT/BiP-boFcγ2R-His载体,将其转染S2细胞后诱导表达出26 ku的boFcγ2R胞外区重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白;Dot-blot结果显示,该蛋白具有较好的生物学功能。蛋白结晶的2个条件是:体积分数15%Tacsimate~(TM)(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350。蛋白初筛晶体无衍射,去糖基化试验验证了boFcγ2R胞外区蛋白初筛晶体无衍射可能与其糖基化有关的推测。【结论】得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白,获得其初筛晶体。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

牛FcγRⅠ(CD64) GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX - 6P- 1,转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导,SDS -PAGE分析表达了N端带有GST的融合蛋白,Western -blotting试验表明融合蛋白在变性条件下能和牛IgG结合。GST -FcγRⅠ融合蛋白的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

鸡Igγ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igγ轻链基因中，并将鸡Igγ轻链信号肽与Pegfp—C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp—C1-SP。鸡Igγ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点，构建了带有信号肽的鸡Igγ轻链／GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后，荧光显微镜观察，重组鸡Igγ轻链／GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达，而载体pEGFP—C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明，牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

PCV2感染对猪肺泡巨噬细胞Fc受体数量和吞噬功能的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照组。用EA花环试验测定Fc受体数目,用吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,来分析PCV2感染对PAM某些生物学活性的影响。结果显示,PAM表面Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后3 d时下降至最低,之后回升,14 d时基本恢复正常。本研究表明,PCV2感染可引起PAM吞噬和清除病原的能力出现短暂下降。     

牛IgG Fc受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中的表达及特性鉴定

从牛肺巨噬细胞cDNA文库中扩增编码牛IgGFc受体Ⅱ(boFcγRⅡ)胞外区基因,PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET28a的T7启动子下游,构建重组表达质粒pETboRⅡ。以pETboRⅡ转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析诱导表达菌体可见分子量约为27kDa的蛋白条带,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblotting和Dotblot检测表明,boFcγRⅡ重组蛋白在变性条件下可与牛IgG特异结合,提示牛FcγRⅡ胞外区可能存在IgG线性结合表位。     

生物制剂用于成人慢性原发免疫性血小板减少症的治疗进展

原发免疫性血小板减少症(ITP)多以糖皮质激素和(或)静脉注射免疫球蛋白等一线治疗为主,但不少慢性ITP患者需二线或更高级药物治疗,如促血小板生成素受体激动剂、利妥昔单抗或联合药物治疗等.现发现新型药物如fostamatinib、新生儿Fc受体(FcRn)抑制剂及新一代促血小板生成素受体激动剂或对成人慢性ITP有较好的...     

IFN-γR和ER在大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴中的共表达

为了探索干扰素-γ受体(IFN-γR)和雌激素受体(ER)在大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴中的相互关系,用免疫组化Max Vision双标法,对正常成年雌性SD大鼠下丘脑、垂体、卵巢中IFN-γR和ER共表达情况及分布特点进行了研究。结果表明,IFN-γR和ER双标记阳性细胞广泛存在于大鼠下丘脑多个核团中,并且也分布在垂体和卵巢组织中;IFN-γR阳性产物主要存在于细胞质中,少数为全细胞着色;ER阳性产物主要存在于整个细胞中,部分为核表达。推测γ-干扰素(IFN-γ)和雌激素在大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴中,以其各自的受体为介导进行两种物质间的信息传递,以此共同参与机体的神经免疫内分泌调节。     

FcγRIIb抑制B细胞内TLR4介导的CD40和CD80表达

利用磁珠法分选野生型和FcγRIIb缺陷小鼠脾脏CD19+B细胞,体外用LPS和/或FcγRIIb配体(IC)刺激24h后,流式细胞术(FCM)检测细胞表面共刺激分子的表达。用蛋白质印迹法检测IC刺激后B细胞内相关蛋白激酶的磷酸化情况。用Lyn抑制剂作用后,FCM检测LPS活化B细胞表面共刺激分子表达探讨B细胞内FcγRIIb对TLR4激动剂(LPS)诱导共刺激分子表达的影响。结果表明:IC抑制LPS活化B细胞表面CD40和CD80的表达,而在FcγRIIb缺陷小鼠B细胞内这一抑制作用消失。IC诱导B细胞内蛋白激酶Lyn的磷酸化,但不能诱导FcγRIIb缺陷小鼠B细胞内Lyn磷酸化。使用Lyn抑制剂后LPS活化B细胞表面CD40的表达上调。说明B细胞内FcγRIIb通过活化Lyn抑制TLR4激动剂诱导的CD40表达。     

鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

下丘脑IFN-γR和ER免疫组化双标技术探索

[目的]选出一种提高下丘脑中雌激素受体(ER)和γ-干扰素受体(IFN-γR)免疫组化双标阳性检出率和染色强度的方法。[方法]用MaxVision法对大鼠下丘脑冰冻切片和石蜡切片分别进行IFN-γR和ER免疫组化双标染色,其中石蜡切片进行抗原微波修复。[结果]下丘脑石蜡切片抗原微波修复后IFN-γR和ER阳性检出率较冰冻切片有明显提高,且双标着色对比鲜明,易于镜下观察。[结论]下丘脑IFN-γR和ER免疫组化双标染色宜选用石蜡切片并进行微波修复,能提高双标阳性率,且显色强,值得推广。     

过氧化体增殖物激活型受体γ对脂质代谢及动脉粥样硬化的影响

过氧化体增殖物激活型受体γ是核受体超家族中的一员,它通过调控靶基因的转录,改善胰岛素抵抗以及脂代谢紊乱,同时对调节内皮功能和抑制血管壁炎症起重要作用。许多体内外研究表明过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂特别是临床上用于治疗2型糖尿病的胰岛素增敏剂噻唑烷二酮在改善脂质代谢紊乱、抑制慢性血管壁炎症、减少斑块形成以及维持斑块稳定性等方面显示了潜在的抗动脉粥样硬化作用,为动脉粥样硬化的治疗提供了新的方向。     

表达可溶性猪唾液酸黏附素重组腺病毒的构建和鉴定

猪唾液酸黏附素(pSn)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染宿主的重要受体。采用RT-PCR和基因合成方法构建能够表达猪Sn蛋白前4个Ig样结构域(Sn4D)和IgG1Fc片段融合蛋白的穿梭载体pShuttle-Sn4D-Fc,利用AdEasyTMAdenoviral Vector System制备重组腺病毒。透射电子显微镜观察表明,构建重组病毒rAd-Fc和rAd-Sn4DFc具有典型腺病毒形态;在重组腺病毒感染的细胞中,RT-PCR能检测到预期的Fc和Sn4D-Fc转录子;在重组腺病毒转导细胞裂解物及培养上清中,Western-blot能检测到预期的28ku Fc或72ku Sn4D-Fc蛋白;从重组病毒转导细胞培养上清中纯化的Fc和Sn4D-Fc蛋白为单一的条带,能被抗猪IgG或Sn抗体识别。结果表明:成功构建了分泌表达猪Fc片段和Sn4D-Fc融合蛋白的重组腺病毒,为用Sn可溶性受体阻断抗PRRSV感染研究打下基础。     

昆虫气味受体研究进展

昆虫的嗅觉是其行为感觉的一种重要信号输入来源,在昆虫的气味识别过程中有多种蛋白质参与,它们在调控昆虫的取食、群集、交尾和产卵等一系列行为中起着重大作用,这些与昆虫嗅觉相关的蛋白主要包括气味结合蛋白(Odorant-binding Proteins,OBPs)、化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)、气味受体(Odorant Receptors,ORs)、离子型受体(Ionotropic Receptors,IRs)、感觉神经元膜蛋白(Sensory Neuron Membrane Proteins,SNMPs)和气味降解酶(Odorant degrading enzyme)等.其中,气味受体是嗅觉系统中的关键成员之一,具有识别气味分子并向下游传递嗅觉信号的重要作用,其介导的气味分子与嗅觉神经元树突上气味受体的专一性结合是重要的嗅觉识别基础.气味受体主要分为两类:传统气味受体和非典型性气味受体,传统气味受体具有识别气味分子的功能,在不同昆虫间的同源性较低;非典型性气味受体不能识别气味分子,它与普通气味受体共表达,协助它们完成对气味分子的识别,在不同昆虫间非典型性气味受体的序列较为保守.气味受体的功能验证主要采用培养细胞系法、电压钳技术和果蝇"空神经元"法,研究昆虫气味受体的功能可为寻找气味配体,开发针对害虫的食物引诱剂和驱避剂、性诱剂以及聚集信息素等奠定理论基础.文章从气味受体的鉴定与分类、结构、表达、系统进化关系以及功能等方面综述了国内外关于气味受体的研究进展,为昆虫嗅觉机制的研究及害虫的预防和治理提供参考.     

鸡Igλ轻链基因克隆、序列分析及其在COS7细胞膜上的定位表达

为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。     

极低密度脂蛋白受体的研究

极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)是一种存在细胞表面的、可识别多种配体的跨膜蛋白,是含有载脂蛋白E(ApoE)的脂蛋白颗粒的受体,在动物体内富含三酰甘油(TG)的脂蛋白的代谢中发挥重要作用。该受体在禽类机体内发挥着介导卵子发生发育的重要生理功能,在哺乳动物机体中主要是参与脂蛋白代谢,可能还有其他生理功能有待于进一步研究。就极低密度脂蛋白受体的分子结构、分布部位、生物学功能以及其基因序列作了简要综述。     

Toll样受体及其对水生动物疾病调控作用的研究进展

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来倍受关注的一类模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),在病原识别、介导机体免疫反应中发挥着重要作用。本研究对Toll样受体的发现、种类、结构、分布、配体及其信号转导途径与功能、在水生动物疾病调控中的作用进行了概述,以期进一步了解TLRs在水生动物疾病中所起的关键作用。     

苦参碱对小菜蛾幼虫γ-氨基丁酸受体基因表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR法,分别于4、8、12、16、20和24 h时,检测了不同浓度苦参碱对小菜蛾幼虫体内γ-GABA受体基因的相对表达量。结果表明,在处理4 h时,以为15.625×10^-3mg/mL的苦参碱处理小菜蛾,其γ-GABA受体基因的表达量达到最大值,为23.62,在20 h时,γ-GABA受体基因的表达量达到最小值,为11.456。在4、8、12、16和20 h时,125×10^-3mg/mL的苦参碱处理小菜蛾幼虫的γ-GABA受体基因的表达量均低于其他的处理,在24 h时,同样浓度处理小菜蛾,其γ-GABA受体基因的表达量高于其他处理,差异显著,在16 h时,同样的浓度处理小菜蛾幼虫γ-GABA受体基因的表达量低于其他处理,达到最小值,为4.345。由此说明苦参碱抑制了小菜蛾体内γ-GABA受体基因的表达。     

稻瘟病菌cAMP受体类GPCR的生物信息学分析

G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类重要的细胞表面受体,通过G蛋白介导着多种生物学途径,其介导的信号转导机制及其作为药物靶标的研究已成为研究热点之一.运用生物信息学的方法,对稻瘟病菌全基因组序列中可能的cAMP类GPCR基因进行了生物信息学分析,为深入研究cAMP类GPCR基因的结构和生物学功能奠定了基础.     

猪源Toll样受体家族(TLRs)及其在抗病育种中的应用

Toll样受体(toll like receptors, TLRs)作为模式识别受体,不仅能够对机体特异性配体进行识别,并通过多种信号传导通路(由髓样分化蛋白88或由β-干扰素TLR结构域衔接蛋白介导)启动信号传导继而引发特异性的免疫应答,同时还在一些由支原体、病毒、细菌等感染引起的免疫应答过程中发挥了重要的调控功能。因为其重要的免疫调控作用,Toll样受体家族已成为近些年研究的热点,对畜禽抗病育种工作也具有重要的科学意义和应用前景。文章综述了猪源TLRs的种类、功能、遗传变异以及介导的信号通路,并重点介绍了猪源TLRs在抗病育种中的应用,旨在为猪Toll样受体家族基因功能研究及有效遗传标记的筛选提供参考依据。