文冠果FAD2的序列与功能分析

脂肪酸脱饱和酶2(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因是油脂合成代谢的关键酶基因,其编码的蛋白催化油酸(18∶1)进一步脱饱和形成亚油酸(18∶2)。本研究以富含油酸和亚油酸2种优质不饱和脂肪酸的文冠果种胚为试材,采用简并引物策略结合RACE技术,克隆了文冠果FAD2的cDNA序列。序列分析表明,文冠果FAD2除具有植物FAD2特有的3个组氨酸区和N端的芳香族氨基酸区外,还具有3个N—糖基化位点和多个磷酸化位点。通过农杆菌介导,将文冠果FAD2转入拟南芥fad2突变体中进行表达分析。气相结果表明,拟南芥fad2突变体缺失亚油酸,而转入文冠果FAD2的拟南芥fad2突变体的种子油中产生了亚油酸,这表明所克隆的文冠果FAD2基因编码的酶具有催化油酸(18∶1)脱饱和成为亚油酸(18∶2)的活性。      

二色补血草硫氧还蛋白过氧化物酶基因LbTPx的克隆及其表达

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个新的硫氧还蛋白过氧化物酶基因(LbTPx)全长cDNA序列.基因全长1016 bp,其中:5'非翻译区146 bp,3'非翻译区69 bp,开放读码框(ORF)801 bp,共编 码266个氨基酸;编码蛋白的分子质量为47.99× 10-24...     

刀鲚Δ6脂肪酸去饱和酶cDNA的克隆与组织表达检测

利用RT-PCR和RACE技术获得刀鲚(Coilia nasus)Δ6脂肪酸去饱和酶(Δ6 fatty acyl desaturase,FAD6)的全长cDNA序列2 032 bp,开放阅读框(ORF)为1 338 bp,编码445个氨基酸。其具有3个保守的组氨酸簇(HDXGH、HXXHH和QXXHH)、2个跨膜区和含亚铁血红素结合基序(HPGG)的细胞色素b5结构域等典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点。氨基酸同源性分析显示,刀鲚FAD6与海鳗(Muraenesox cinereus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)等海水鱼类的相似性达75%~79%,而与淡水鱼类的相似性较低。系统进化分析也显示,其与海水鱼类的亲缘关系较近。荧光定量PCR检测发现该基因在刀鲚脑和肠中高表达,肌肉和肝脏相对高表达,心脏、肾脏和鳃低表达。     

陆地棉脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1的克隆与表达分析

Δ12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1是控制种子中单不饱和脂肪酸油酸(C18∶1)向多不饱和脂肪酸亚油酸(C18∶2)转化的关键基因,其表达水平决定植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。采用同源克隆技术获得棉花品种新陆早33号的GhFAD2-1基因,该基因编码区全长1 158 bp,共编码385个氨基酸;生物信息学分析结果表明,GhFAD2-1基因序列具有1个典型的FAD2结构域和1个FAD2-N端结构,其氨基酸序列与橄榄、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性较高,在75%～78%之间。利用qRT-PCR技术分析发现,GhFAD2-1基因的表达量随着棉籽的发育呈先升高后降低的趋势,开花后40 d达到其表达峰值。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定其脂肪酸组成,结果表明,开花后0～40 d,C18∶1含量/C18∶2含量与GhFAD2-1基因表达量变化趋势相反。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。     

红花油酸去饱和酶基因的克隆及序列分析

【目的】对红花油酸去饱和酶FAD2基因进行克隆和生物信息学分析,为深入研究该酶的功能提供理论依据。【方法】提取红花种子总RNA,通过RT-PCR方法进行反转录,PCR扩增得到FAD2基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法,对红花FAD2氨基酸序列的理化性质、系统进化、蛋白定位和跨膜区域等进行预测和分析。【结果】成功克隆获得了红花FAD2基因,其开放阅读框cDNA长1 140bp,编码380个氨基酸,预测分子质量43.6ku,理论等电点8.37,带有正电残基(强酸性)30个、负电残基(强碱性)34个。FAD2蛋白含有3个极度保守的His-Box,不存在明显的信号肽,存在6个跨膜结构域,与疏水区域预测结果一致。红花FAD2核苷酸的分子进化树分析显示,其与日本栽培稻的亲缘关系较近。红花FAD2氨基酸序列比对结果表明,不同植物的FAD2具有较高的同源性,同源性平均达72.94%。【结论】成功克隆了红花FAD2基因,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

毛竹cab-PhE11基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术和RACE-PCR技术,从毛竹(Phyllostachys edulis)中分离了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA编码区全长,命名为cab-PhE11(GenBank登记号:EU327783)。该基因全长1154 bp,编码区cDNA全长753 bp,编码250个氨基酸。生物信息学分析表明,在cab-PhE11编码的蛋白第62~239位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,还包含1个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酸化位点以及1个丙氨酸富集区。序列相似性分析结果表明,cab-PhE11编码的氨基酸序列与玉米、绿豆、拟南芥、烟草等的cab基因有较高的相似性,都在80%以上,该基因属于lhcb6类基因。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

黄瓜质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析(英文)

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10cDNA共1117bp,包含55bp的5’端非编码区,一个540bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522bp的3’端非编码区。其中,3’非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

辣椒质膜水通道蛋白CaPIP1基因全长cDNA的分离及序列分析

通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与烟草水通道蛋白NtAQP1高度同源的aquaporin基因全长cDNA,命名为CaPIP1。序列分析结果表明该cDNA包含有858 bp的完整开放阅读框,编码286个氨基酸,具有6个跨膜区,2个NPA模序以及植物质膜水通道蛋白高度保守的序列。氨基酸同源性及进化分析同样表明CaPIP1为辣椒水通道蛋白家族新成员。     

百子莲赤霉素受体基因ApGID1全长的克隆及功能分析

为揭示赤霉素(gibberellin,GA)对根茎类花卉百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)生长发育的调控机制,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲GA受体基因GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1(GID1)全长cDNA,命名为ApGID1。该基因cDNA全长为1 629bp,其中5’非编码区(untranslated region,UTR)372bp,3’端UTR 213bp;编码区全长为1 044bp,共编码347个氨基酸;结构预测显示,ApGID1蛋白由8条β-折叠和7个α-螺旋组成袋状结构域,能够与GA分子结合。推导的ApGID1蛋白氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hisutum)具有较高的同源性,可达71.8%。系统进化表明,百子莲与单子叶植物小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)和玉米(Zea mays)聚为一类,与双子叶植物进化关系较远。ApGID1基因在根、茎和花药中表达量高。亚细胞定位显示ApGID1是核蛋白,是GA信号通路的重要组成部分。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达ApGID1可促进开花和株高建成。     

高羊茅FaGF14-B和FaGF14-C基因的克隆与差异表达分析（英文）

[目的]克隆高羊茅FaGF14-B和FaGF14-C基因并进行基因的差异表达分析,为后续基因功能研究提供依据。[方法]以高羊茅转录组学测序获得的FaGF14-B和FaGF14-C基因序列片段为模板,利用3'RACE和5'RACE方法从高羊茅中扩增出FaGF14-B和FaGF14-C基因的全长cDNA序列,命名为FaGF14-B和Fa GF14-C,并进行核酸序列分析、基因编码蛋白分析、蛋白保守结构域分析、系统进化树分析与差异表达分析。[结果]FaGF14-B基因序列cDNA全长1 548 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,449~1 228 bp),编码蛋白为260个氨基酸;FaGF14-C基因序列c DNA全长1 250 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,66~848 bp),编码蛋白含有261个氨基酸;GF14-B和GF14-C蛋白都具有典型的14-3-3蛋白结构域,二级结构包含9个保守的α-螺旋及不保守的N-末端和C-末端。系统进化树分析表明,高羊茅Fa GF14-B和FaGF14-C与禾本科植物GF14蛋白具有较高的相似性,位于在同一个进化支上,亲缘关系较近;荧光定量PCR分析表明:FaGF14-B和FaGF14-C基因应答氮胁迫处理。[结论]该研究可为进一步筛选抗低氮胁迫相关基因、创制耐低氮的牧草新种质奠定理论基础。     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。