棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建(英文)

采用RT-PCR方法克隆了棉花-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体,pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302-amiRNA-FAD2-1。     

紫苏脂肪酸去饱和酶基因PfFAD2的生物信息学及表达特性分析

为研究脂肪酸去饱和酶基因FAD2在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的重要作用,对紫苏FAD2基因及其编码的蛋白质序列进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏FAD2基因cDNA全长序列为1 545 bp,ORF为1 149 bp,共编码382个氨基酸残基;紫苏FAD2蛋白属于亲水性蛋白,具有6个典型的跨膜螺旋区,含有PLN02505保守结构域,属于Membrane-FADS-like超蛋白家族;系统进化树分析结果表明,紫苏与芡欧鼠尾草的亲缘关系较近,与红花较远。利用荧光定量PCR技术分析紫苏不同组织以及不同发育时期的种子中FAD2基因的表达特性,结果表明,紫苏FAD2在开花后20 d的种子中表达量最高。研究结果可为进一步阐明紫苏脂肪酸代谢机制奠定理论基础。     

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。     

油菜FAD2 基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种"中双9号"中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点p I值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体p BILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸(C18∶1)的含量从53.8%降低到12.4%~34.1%,亚油酸(C18∶2)含量从2.9%提高到11.5%~62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜Bn FAD2基因具有完整的催化功能。     

文冠果FAD2的序列与功能分析

脂肪酸脱饱和酶2(fatty acid desaturase 2, FAD2)基因是油脂合成代谢的关键酶基因,其编码的蛋白催化油酸(18∶1)进一步脱饱和形成亚油酸(18∶2)。本研究以富含油酸和亚油酸2种优质不饱和脂肪酸的文冠果种胚为试材,采用简并引物策略结合RACE技术,克隆了文冠果FAD2的cDNA序列。序列分析表明,文冠果FAD2除具有植物FAD2特有的3个组氨酸区和N端的芳香族氨基酸区外,还具有3个N—糖基化位点和多个磷酸化位点。通过农杆菌介导,将文冠果FAD2转入拟南芥fad2突变体中进行表达分析。气相结果表明,拟南芥fad2突变体缺失亚油酸,而转入文冠果FAD2的拟南芥fad2突变体的种子油中产生了亚油酸,这表明所克隆的文冠果FAD2基因编码的酶具有催化油酸(18∶1)脱饱和成为亚油酸(18∶2)的活性。      

甘蓝型油菜种子发育过程中主要脂肪酸的积累及相关分析

为研究甘蓝型油菜种子发育过程中主要脂肪酸地域间积累差异及相互关系,比较了高油材料3种主要脂肪酸在3个地方(南京、西宁和拉萨)的积累过程和△12脂肪酸脱饱和酶(FAD2)、△15脂肪酸脱饱和酶(FAD3)相对活性动态变化.结果表明:甘蓝型油菜种子发育过程中油酸(C18∶1)含量不断增加,亚油酸(C18∶2)含量持续下降,两者呈极显著负相关,亚麻酸(C18∶3)含量变化不大.油酸与亚麻酸间、亚油酸与亚麻酸间相关关系均不显著.种子发育过程中不同海拔地区间油酸、亚油酸积累存在明显的差异.南京样品油酸积累速度最快,西宁样品次之,拉萨样品最低;拉萨样品油酸的快速积累比其他2个地点的样品晚10 d左右.南京样品亚油酸含量下降开始时间比其他2个地点提前10 d左右.种子发育过程中与油酸、亚油酸合成相关的FAD2相对活性不断下降,FAD3相对活性不断升高.拉萨样品FAD2相对活性下降开始时间较晚,为开花后29 d,下降速率最大;南京和西宁样品下降开始时间较早,均为开花后19 d,下降速率相等.不同海拔地区间FAD2相对活性差异可能与日最高温度有关.     

油用牡丹脂肪酸脱氢酶基因FAD3的克隆与表达分析

【目的】ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 FAD)为植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶,通过对油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因结构特征及其在不同组织中的表达模式进行分析,为研究FAD3在油用牡丹‘凤丹’脂肪酸形成过程中的调控提供理论基础。【方法】采用RACE和RT-PCR的方法克隆油用牡丹‘凤丹’ω-3 FAD基因,用Vector NTI Advance 11软件进行序列分析,BLAST进行同源性比较,并用MEGA7.0的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,利用在线蛋白质分析工具Ex PASy预测FAD3蛋白的基本参数和特性,利用Phyre2预测蛋白质二级和三级结构,并通过实时荧光定量PCR检测该基因在油用牡丹‘凤丹’不同发育期的种子以及不同组织中的特异性表达情况。【结果】获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶FAD3,命名为FAD3(Gen Bank登录号:KX906966)。序列分析表明该基因c DNA序列全长1 723 bp,其中,开放阅读框1 308 bp,编码435个氨基酸,3′端非编码区长287 bp,5′末端非编码区长99 bp,预测成熟蛋白分子量为49.9 k D,理论等电点(p I)为7.42,N端无信号肽,脂肪系数为83.08,不稳定指数35.67,总水平亲水性为-0.222。经FAD3蛋白的二级结构预测,FAD3以α-螺旋、随机卷曲为主,其次是延伸链、β-转角含量较少;多序列比对结果表明,油用牡丹FAD3氨基酸序列含有2个保守结构域,系统发育分析结果显示‘凤丹’与芍药处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,FAD3蛋白有3个跨膜区域,可能定位于内质网中发挥功能。组织特异性结果分析表明,FAD3在‘凤丹’的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,雌蕊次之,在雄蕊中表达量最低;不同时期种子中,10 d表达量最高,20 d次之,在60 d中表达量最低。【结论】成功从油用牡丹‘凤丹’中克隆获得FAD3全长c DNA序列,其在‘凤丹’不同组织中呈现出多种表达模式。     

三种栽培棉籽油脂组成及相关基因表达分析

[目的]棉籽油脂是植物油脂的重要来源,对其组成和含量的研究对提高棉籽油利用率以及棉花综合利用有重要作用。棉籽油脂肪酸合成途径受到多种相关酶的调节,明确棉花油脂代谢过程的一些相关酶基因的表达水平,不仅能够阐明棉籽油脂组成的分子基础,而且还对定向改造棉籽油组成、专用型棉花品种育种提供理论依据和指导。[方法]本文以3种栽培棉为材料,提取棉籽油进行粗脂肪定量,利用气相色谱分析(GC)脂肪酸组成和含量,利用qRT-PCR技术分析4个相关酶基因在胚珠中的表达水平。[结果]棉籽油主要脂肪酸成分为亚油酸(18∶2)、棕榈酸(16∶0)、油酸(18∶1)和硬脂酸(18∶0),含量最高的是亚油酸(18∶2),含量最低的是硬脂酸(18∶0)。表达分析表明,Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的表达量最高,其它3个酶基因的表达有一定的差异。[结论]本研究不仅比较了3种栽培棉籽脂肪酸组成和含量,而且还明确了其脂肪酸组成的分子遗传基础。     

麻风树脂肪酸去饱和酶7基因的克隆及生物信息学分析

质体型ω-3(Δ15)脂肪酸去饱和酶(FAD7)是多不饱和脂肪酸合成途径中催化亚油酸(Δ9,12-C18∶2)形成α-亚麻酸(Δ9,12,15-C18∶3,ALA)的关键酶。基于麻风树低温锻炼转录组数据,通过逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆到麻风树FAD7基因的全长cDNA,命名为JcFAD7。结果表明,该cDNA序列全长1 796 bp,完整开放阅读框1 341 bp,编码446个氨基酸,理论分子量为51.1 ku,等电点为8.92。序列分析表明,JcFAD7编码蛋白包含膜结合FAD蛋白的4个跨膜区、2个膜嵌合区、1个亚铁血红素结合基序及3个组氨酸簇等特征区域。构建系统进化树显示,麻风树JcFAD7蛋白与芍药(Paeonia lactiflora)的亲缘关系最近。     

亚麻荠FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的生物信息学分析

△-12脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15脂肪酸脱氢酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亚油酸(18∶2;ω-6)和亚麻酸(18∶3;ω-3)合成的限速酶,亦在植物抵御低温等环境胁迫反应中起重要作用。本文利用生物信息学工具分析了亚麻荠(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构、保守域和功能系统进化等特征。结果表明,FAD2-1和FAD3-1编码蛋白理论pI相近(分别为8.39和8.42),然而前者不稳定系数(40.04)显著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位点为23个,多于FAD3磷酸化位点(18个),预示FAD2-1更易受翻译后调控。这两种蛋白均含有3个保守的组氨酸富集区(Hisbox),且在C端含有内质网滞留信号,赋予其定位于内质网和催化双键形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%),然而后者无规则卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D结构模拟显示,FAD2-1和FAD3-1功能域大小和构象存在差异,这可能影响到底物选择性和催化效率。这些结果为全面解析亚麻荠种子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子机理提供了科学参考。     

油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定

为研究油葵FAD2-1基因在脂肪酸合成中的催化功能,利用RT-PCR技术,从油葵品种新葵杂4号未成熟种子中克隆HaFAD2-1基因的全长cDNA序列。将该基因序列构建穿梭表达载体pYES2-HaFAD2-1,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中。将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行GC-MS分析。结果显示,HaFAD2-1基因编码一个长378个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子质量43 719,等电点(pI)为8.38,具有3个高度保守的组氨酸簇。脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明HaFAD2-1基因在酿酒酵母中获得表达,能将油酸转化为亚油酸,证明克隆得到的HaFAD2-1具有完整的催化功能。     

一个凤丹PoFAD2基因家族新成员PoFAD2-2的克隆及表达模式分析

脂肪酸脱氢酶2(FAD2)能将油酸催化成亚油酸,是单不饱和脂肪酸转化为多不饱和脂肪酸的关键酶。本研究根据筛选到的PoFAD2-2基因序列,克隆到凤丹PoFAD2-2基因全长的c DNA,命名为PoFAD2-2。其开放阅读框为1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白质分子量为44 000,等电点为8. 51。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质偏亲水性,包含5个跨膜结构域,属于膜结合型的FAD超家族。多序列比对与系统进化树分析结果发现,PoFAD2-2基因与PoFAD2-1基因亲缘关系较远,对于PoFAD2-2基因,凤丹在进化上与油橄榄[Olea europaea(common olive)(KY652929.1)]、靛木[Wrightia tinctoria (GU190864.1)]的相似性较高。荧光定量分析结果表明,PoFAD2-2在根和子房中没有表达,在花中的相对表达量最高,随着种子逐渐成熟,PoFAD2-2在种子中的表达量先逐渐降低再升高然后再降低,表明此基因表达具有组织特异性。PoFAD2-2基因在种子发育进程中的表达趋势与PoFAD2-1相同。     

花生AhFAD2-2基因的克隆与表达分析

脂肪酸脱氢酶(FAD)能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示,2个基因的ORF区均为1 152 bp,编码383个氨基酸;c DNA水平上有12个碱基差异位点,其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变;它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp,在5'UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示,这两个基因为组成型表达,其中在叶片中的表达量最高,花和根中次之,茎与种子中表达量最低。低温处理下,幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加,至12 h达最高值,随后表达量逐渐下降,说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。     

甘蓝型油菜△12-脂肪酸脱氢酶基因(BnFAD2)cDNA序列的克隆及其对烟草的转化

通过PCR方法从甘蓝型油菜基因组DNA中克隆出△12-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD2的cDNA序列,全长1155bp,编码384个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜FAD2基因(AF243045)的相似性为99%.将其克隆到植物表达载体pZP212上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89品种,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,得到阳性植株15棵.     

拟南芥AtFAD6基因突变体的构建

运用优化后的CRISPR/Cas9基因编辑载体,创建了2个不同的拟南芥脂肪酸去饱和酶6基因(AtFAD6)突变体,其AtFAD6基因的保守位点氨基酸序列均发生变化,同时终止密码子被提前引入,基因功能丧失.脂肪酸组分分析结果显示,这2种突变体的叶片中单不饱和脂肪酸16:1和18:1大量积累,多不饱和脂肪酸16:3和18:3含量则大幅下降,同时伴随着叶片发黄、地上部生物量显著降低、抽薹提前2～3 d的表型变化.多不饱和脂肪酸18:3作为茉莉酸合成的前体物质,其含量的下降致使突变体中茉莉酸信号标记基因AtVSP1在叶片中的表达量有所降低,而茎中的表达量提高了40％以上.所获得的2个AtFAD6功能丧失型突变体为进一步研究脂类代谢与植物生长发育之间的关系提供了重要的遗传材料.     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

[目的]w-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸(18∶1)去饱和形成亚油酸(18∶2),是多不饱和脂肪酸合成过程中的第一个关键酶。为了探究DsFAD2在盐藻油脂合成积累中的作用。[方法]本文以运城盐湖分离的富油杜氏盐藻(Dunaliella salina)株系(YC-011)为材料,利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因,并对DsFAD2编码蛋白进行了跨膜区、高级结构及氨基酸序列比对等一系列生物信息学分析。应用qRT-PCR检测DsFAD2基因在氮(N)胁迫培养条件下的表达模式。[结果]DsFAD2蛋白定位于内质网中,有5个跨膜区,具有典型膜结合蛋白的结构特征。此外,DsFAD2也具有所有FAD2蛋白家族所特有的3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列。系统发育分析发现杜氏盐藻DsFAD2与莱茵衣藻CrFAD2、团藻VcFAD2亲缘关系最近。qRT-PCR表明,与正常培养的杜氏盐藻相比,缺N培养显著诱导DsFAD2上调表达,N胁迫8d时DsFAD2的表达量是未胁迫对照的2.8倍。[结论]DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应,促进多不饱和脂肪酸形成,增强藻细胞抗逆性。本研究为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考。     

紫苏PfPDCT基因序列特征及表达分析

采用生物信息学技术和在线分析软件对紫苏PfPDCT基因序列及所编码的蛋白质进行分析,并且利用实时荧光定量PCR技术研究该基因在晋紫苏1号种子发育不同时期的表达特性,旨在探究磷脂酰胆碱甘油二脂转磷酸胆碱酶(PDCT)在植物脂肪酸代谢过程的作用。结果表明,紫苏PfPDCT基因c DNA全长序列为2 098 bp,开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,PfPDCT蛋白分子量约为59.315 ku,等电点为9.48,不稳定系数为35.00,推测其为稳定蛋白,与已知赤藓PDCT蛋白高度同源。通过荧光定量PCR分析可知,紫苏PfPDCT基因在不同发育时期的种子中均有表达,其中,在开花后20 d表达量最高,为开花后10 d的1.92倍。研究结果可为进一步阐明紫苏PfPDCT基因的功能及作用机制奠定基础。     

棉花GhFAD2-1基因5’UTR内含子的克隆与序列分析

【目的】对棉花~(Δ12)-油酸去饱和酶基因Gh FAD2-1 5'UTR区的内含子进行克隆和序列分析,为研究Gh FAD2-1的表达调控奠定基础。【方法】利用5'RACE技术,克隆Gh FAD2-1的5'UTR序列,结合棉花基因组序列,克隆Gh FAD2-1 5'UTR内含子,并利用PLACE等生物信息学软件对其顺式作用原件进行分析。【结果】棉花A、D基因组的Gh FAD2-1 5'UTR中各含一内含子序列,全长分别为1 103 bp、1 111 bp;Gh FAD2-1成熟mRNA的5'UTR为77bp,转录的起点碱基为T;5'UTR内含子两个剪切位点分别AA-GG、CA-GC。该内含子包括一些典型的与光响应相关的作用元件,以及与激素和胁迫因素相关的应答元件等。【结论】克隆获得了棉花A、D基因组的Gh FAD2-1基因5'UTR内含子序列;明确其转录的起点碱基及5'UTR内含子的剪切位点,为进一步在分子水平上研究Gh FAD2-1功能及其表达调控规律,为植物的遗传改良奠定了基础。     

外源MeJA对低温下紫苏脂肪酸合成及FAD3基因表达的调控

[目的]茉莉酸甲酯(MeJA)是调节植物应激反应的天然植物生长调节物质,探讨其对低温胁迫下紫苏幼苗抗冷性的影响,为紫苏抗逆机制的研究提供理论依据。[方法]以紫苏品种"晋紫苏1号"为试验材料,在其长出4片真叶后分别进行4℃低温胁迫和0.025mmol·L~(-1 )MeJA+4℃低温胁迫处理,分析处理0、3、6、9、12、24h后紫苏幼苗叶片中脂肪酸组分及含量、相对电导率、丙二醛含量以及ω-3脂肪酸脱氢酶基因(FAD3)的相对表达量。[结果]MeJA+4℃处理后,不饱和脂肪酸C18∶3的含量急剧上升,处理6h时为对照的6.96倍,且不同处理条件下,紫苏叶片总脂肪酸含量均显著上升;经外源MeJA处理后,随着低温胁迫时间的延长,相对电导率和MDA含量都比4℃胁迫处理时显著降低;MeJA+4℃胁迫处理3h时FAD3基因的表达量达到最高,为对照的15.9倍。[结论]在外源MeJA协同低温处理下,诱导FAD3基因高量表达,不饱和脂肪酸含量增加,紫苏细胞膜完整性较好,幼苗抗冷性增强。