油菜油体蛋白基因启动子的克隆及在油葵中的功能验证

利用PCR技术,从油菜(Brassica campestris)基因组DNA中克隆20 ku油体蛋白基因上游903 bp的调控序列NOP,将其与GUS基因融合构建植物表达载体,利用花粉管通道法转化油葵并进行PCR扩增,组织化学染色检测启动子和GUS基因在油葵基因组中的整合和表达情况。结果表明,NOP序列1~903 bp与报道序列同源性为95%,包含驱动基因表达的重要元件及驱动基因在种子中特异表达所必需的核苷酸序列;目的片段已整合到油葵基因组中,NOP具有种子特异性启动子的功能,能够驱动GUS基因在油葵种子中特异性表达,而在油葵根、茎、叶中均不表达。     

紫苏PfDGAT1酵母功能互补分析

[目的]本试验将已克隆的紫苏种子中高表达二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因PfDGAT1转化至酿酒酵母突变型菌株H1246进行酵母互补功能验证,研究二酰甘油酰基转移酶是否具有催化油脂合成的作用。[方法]通过构建紫苏DGAT基因的酵母表达载体pYES2.0-PfDGAT1并转化至酿酒酵母突变型菌株H1246,用尼罗红对转基因酵母细胞染色,检测转基因酵母中是否能合成油体;利用薄层层析(TLC)试验检测转基因酵母中是否存在三酰甘油(TAG)。[结果]转pYES2.0-PfDGAT1载体的突变型酵母菌株H1246能够检测到有油体存在,而转pYES2.0空载体的突变型酵母菌株H1246中没有检测到油体,说明紫苏PfDGAT1基因的表达恢复了酿酒酵母突变型菌株H1246油体缺陷的表型,可以催化TAG合成。[结论]PfDGAT1基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,该研究结果为深入解析PfDGAT1基因在紫苏油脂合成途径中的功能奠定了基础。     

葡萄芪合酶基因cDNA片段酵母表达载体的构建及其在酿酒酵母中的表达

应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。     

柽柳硫氧还蛋白过氧化物酶(ThPrx1)基因转入酵母的抗逆能力分析

从柽柳(Tamarix hispida)中克隆到了一个硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族基因(ThPrx1).为了研究ThPrxl的抗逆功能,将ThPrx1基因构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,获得重组酵母,并用转空pYES...     

一个凤丹PoFAD2基因家族新成员PoFAD2-2的克隆及表达模式分析

脂肪酸脱氢酶2(FAD2)能将油酸催化成亚油酸,是单不饱和脂肪酸转化为多不饱和脂肪酸的关键酶。本研究根据筛选到的PoFAD2-2基因序列,克隆到凤丹PoFAD2-2基因全长的c DNA,命名为PoFAD2-2。其开放阅读框为1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白质分子量为44 000,等电点为8. 51。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质偏亲水性,包含5个跨膜结构域,属于膜结合型的FAD超家族。多序列比对与系统进化树分析结果发现,PoFAD2-2基因与PoFAD2-1基因亲缘关系较远,对于PoFAD2-2基因,凤丹在进化上与油橄榄[Olea europaea(common olive)(KY652929.1)]、靛木[Wrightia tinctoria (GU190864.1)]的相似性较高。荧光定量分析结果表明,PoFAD2-2在根和子房中没有表达,在花中的相对表达量最高,随着种子逐渐成熟,PoFAD2-2在种子中的表达量先逐渐降低再升高然后再降低,表明此基因表达具有组织特异性。PoFAD2-2基因在种子发育进程中的表达趋势与PoFAD2-1相同。     

油菜FAD2 基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种"中双9号"中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点p I值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体p BILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸(C18∶1)的含量从53.8%降低到12.4%~34.1%,亚油酸(C18∶2)含量从2.9%提高到11.5%~62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜Bn FAD2基因具有完整的催化功能。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体的构建与转化

内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶(FAD3)是不饱和脂肪酸合成途径中催化十八碳二烯酸[18∶2(9,12)]转化为十八碳三烯酸[18∶3(9,12,15)]的关键酶。通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到LeFAD3的全长cDNA,基因全长为1 184bp,开放阅读框(ORF)为1 134bp,注册号为EU251190。将该基因正反向序列分别插入带有35S-CaMV启动子pBI121表达载体下游,获得正、反义表达载体,转化农杆菌LBA4404,利用农杆菌介导法转化番茄,获得转基因番茄植株。     

油葵油酸去饱和酶基因的序列分析

该研究利用生物信息学软件对克隆得到的油葵基因fad2序列进行核苷酸结构和蛋白质结构分析,结果表明油葵中fad2基因编码382个氨基酸,含有完整的ORF框;其功能域为△-12脂肪酸去饱和酶类结构域,含有3个保守的组氨酸簇;蛋白质二级结构中包含14个α螺旋,7个β折叠,此外还含有17个具有二级结构趋势的无规则卷曲;蛋白质羧基末端以YXXKI结尾,符合Phi-X-X-K/R/D/E-Phi-COOH基序序列规则,是内质网滞留信号;从系统发育进化的角度可知油葵与橄榄的亲缘关系较近。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆菌介导甘蓝型油菜的遗传转化

月桂酸是在清洁用品和医药产品中有重要用途的中链脂肪酸。椰子中富含月桂酸特异的溶磷脂酸酰基转移酶基因,克隆该基因在油菜中表达若可获得含月桂酸的油菜新种质,将具有良好的应用价值。为获得脂肪酸成分改良的油菜种质资源,从椰子胚乳中克隆出该基因并构建35S驱动的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化油菜子叶柄,在获得的约20株的转化苗中已鉴定有6株转化植株。     

棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建(英文)

采用RT-PCR方法克隆了棉花-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体,pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302-amiRNA-FAD2-1。     

木霉T88 β-l,6-葡聚糖酶(BGN16.2)的基因克隆、表达及同源建模

利用RT-PCR方法克隆得到β-l,6-葡聚糖酶BGN16.2的cDNA序列,并采用半定量RT-PCR法,研究以茯苓粉及病原菌细胞壁为诱导物对该基因诱导表达的影响。构建该酶基因到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,用CMC糖化力法对目的基因表达产物的酶活性进行检测。克隆得到BGN16.2的cDNA基因开放阅读框长度为1290bp,编码429个氨基酸,推测蛋白分子量为48kDa,预测的等电点pI为5.25。该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的β-l,6-葡聚糖酶并分泌到胞外。发酵液中的酶活在培养60h时达到最高(2.1U·mL-1),最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.5。对该酶的一二级结构进行生物信息学分析的基础上,利用同源建模的方法完成了该酶的活性区域三级结构的建模。     

核桃JrGSTTau1基因的克隆及转入酵母的抗逆功能分析

为筛选核桃(Juglans regia)抗逆相关的功能候选基因,研究克隆获得一条核桃Tau亚家族GST基因(JrGSTTau1),并将该基因插入酵母表达载体pYES2中构建重组酵母pYES2-JrGSTTau1,将重组载体转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1,同时以转化空载体pYES2的重组酵母作为阴性对照。在酵母表达系统中研究该基因的抗逆功能。结果表明,JrGSTTau1的开放读码框(ORF)全长690bp,拟推导的蛋白分子量为26.856kDa,含有氨基酸数为229,理论等电点为6.02。对2种酵母进行NaCl、CdCl2、-20℃和53℃胁迫处理,比较发现JrGSTTau1转基因酵母表现出较对照更高的生命力和成活率。表明JrGSTTau1基因能有效提高酵母的耐盐抗镉及抵抗异常温度的能力,JrGSTTau1可作为核桃逆境应答的候选基因。     

甘蓝型油菜△12-脂肪酸脱氢酶基因(BnFAD2)cDNA序列的克隆及其对烟草的转化

通过PCR方法从甘蓝型油菜基因组DNA中克隆出△12-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD2的cDNA序列,全长1155bp,编码384个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜FAD2基因(AF243045)的相似性为99%.将其克隆到植物表达载体pZP212上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89品种,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,得到阳性植株15棵.     

三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因克隆、过表达载体构建及生物信息学分析

通过RT-PCR的方法克隆三角褐指藻的△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA序列,利用双酶切技术构建重组表达载体,并对该基因进行相关的生物信息学分析。结果表明:三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因的cDNA全长为834 bp,编码278个氨基酸,预测的等电点为9.13,理论分子量32 348.91。△5-脂肪酸延长酶基因中存在1个内含子,该酶属于ELO系列延长酶,可能定位于内质网中,包含多个跨膜区域和保守区域。亲缘关系分析表明,三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶与假微型海链藻的亲缘关系最近。试验还成功构建了三角褐指藻△5-脂肪酸延长酶基因过表达重组质粒pPha-T1-5e,为下一步三角褐指藻中相关油脂代谢基因的表达和功能验证奠定基础。     

类黄酮异戊烯转移酶基因在酿酒酵母中的表达

[目的]对类黄酮异戊烯转移酶基因在酿酒酵母中的表达进行研究。[方法]以粗毛淫羊藿为材料,对其类黄酮异戊烯转移酶基因(EaPT1)进行克隆,并构建重组质粒,将其转化至酿酒酵母INVSc1中表达,进行黄酮类底物粗酶检测。[结果]获得了大小约1 200 bp的EaPT1基因;经SDS-PAGE检测,重组质粒转化后的酵母菌有疑似EaPT1的表达产物;粗酶检测中未能检测到EaPT1酶活性。[结论]为粗毛淫羊藿植物次生代谢,特别是类黄酮生物合成途径的解析奠定基础。     

油葵转化体系建立和重组人胰岛素的初步表达

为建立并研究利用油葵油体表达系统表达重组人胰岛素蛋白的方法,采用PCR技术构建植物种子特异性表达载体,经花粉管通道用重组人胰岛素基因转化油葵。利用PCR法检测目的基因的转化情况,用SDS-PAGE和Western blot对胰岛素蛋白的表达进行鉴定。结果表明,合成了重组人胰岛素与花生油体蛋白融合基因,并获得植物种子特异性表达载体p BINOI。花粉管通道转化油葵的适宜条件为,花柱剪切1/2,质粒浓度为50~100 ng/μl转化效率最高。PCR结果显示,油葵花粉管通道法转胰岛素基因总转化率为3.2%,温室转化率(5.20%)高于大田转化率(1.12%)。获得T1~T5代转基因种子,播种为T1~T5代植株。获得的1号转基因株系T5代植株阳性/阴性植株为11∶1。经SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测结果显示,融合蛋白约为23 k Da,重组人胰岛素基因在油葵种子中得到了表达。本实验建立了转基因油葵油体表达系统,且该系统能够成功表达重组人胰岛素。     

酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达

【目的】克隆酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）耐盐基因HAL1（halotolerance）并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能。【方法】根据NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母As2.375中克隆该基因。选择酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI121-ScHAL1::GFP融合表达载体。以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究。采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T0棉花转基因种子。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因T0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析。【结果】从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bp,共编码294个氨基酸。对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白。根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折叠片构成。棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达。用100 mmol·L^-1 NaCl盐溶液对转基因棉花T0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性。根据基因核苷酸序列设计2对引物对T0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功。对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现,在600 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1 NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mmol·L^-1 NaCl溶液处理后的叶盘。【结论】成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用。     

芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

应用基因工程技术将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段（Stilbene synthase，STS）进行PCR扩增；把回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-TEasy中进行测序与序列分析；采用定向克隆的方法将芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型酿酒酵母表达载体pYES6／CT上，转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVScl，酵母菌落PCR电泳结果显示，在约1200bp处有一条亮带，证明芪合酶基因酵母表达载体构建成功，为后期工作的开展奠定了基础，并为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的实验素材。     

三角褐指藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因克隆及其表达分析

γ-亚麻酸在人类的健康与营养中具有重要的功能,利用基因工程手段提高其产量是满足其需求日益增大的途径之一。Δ6脂肪酸脱饱和酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶,催化亚油酸（C18∶2 Δ9,12）到γ-亚麻酸（C18∶2 Δ6,9,12）的反应。通过克隆三角褐指藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因,并连入酵母表达载体pPIC3.5K中,在毕赤酵母中进行了表达,结果表明：重组酵母经甲醇诱导后表达转入的外源基因,气-质联用分析显示重组毕赤酵母中含有γ-亚麻酸和SDA（18∶4 Δ6,9,12,15）,其含量分别为2.5%和0.8%。