番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

反义LeEIL2基因表达载体的构建及在番茄中的转化

为了研究LeEIL2基因在番茄果实成熟过程中的作用 ,将全长的番茄LeEIL2基因以反义方向构建到植物表达载体 pBI1 2 1上 ,经过酶切鉴定正确后 ,将该载体转入农杆菌EHA1 0 5中 ,通过农杆菌介导法转化番茄 ,经组织培养和抗性筛选获得再生植株 ,PCR检测再生植株 ,初步鉴定为阳性植株 ,为获得转反义LeEIL2番茄果实打下基础。     

甘蓝型油菜脂肪酸延长酶FAE1 RNA干扰体的构建

利用来源于油菜fael基因编码区的长498bp的2个片段，反向连接于1个83bp的内含子两端，构建成RNAi载体，以期在油菜中转录后能有效抑制fael基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长2066bp，经限制性内切酶消化及序列测定验证，其序列结构与设计一致。通过农杆菌介导的油菜转化，获得油菜再生株系29个。     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

番茄叶片液泡转化酶基因植物反义表达载体的构建与瞬时表达

在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PCR和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落PCR表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。     

RACE方法获得番茄蓝光受体基因Phototropin-2全长及其过量表达载体的构建

采用RACE及降落PCR技术从番茄幼苗总RNA中克隆出PHOT-2基因的3’及5’末端片断,并根据测序结果,设计拉基因全长引物获得了PHOT-2基因全长。结果表明,该基因全长3 381 bp,含开放阅读框2 856 bp,编码952个氨基酸;与拟南芥PHOT-2氨基酸序列相比,同源性高达68%,主要功能区域同源性高达99%。将番茄PHOT-2基因定向插入pHB质粒中构建成过量表达载体,重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。     

水稻类黄酮3''-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3’H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3’H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3’H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3’H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3’H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3’H基因,进一步研究F3’H基因功能奠定基础。     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

L-半乳糖脱氢酶(GalDH)是L-半乳糖途径合成抗坏血酸(ASA)的关键酶之一,为了研究GalDH基因的功能,获得转基因植株,用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ将已克隆的阔叶猕猴桃GalDH基因从克隆载体pMD-19T切下,定向插入到植物表达载体pCSB,成功构建阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体pCSB-GalDH及工程农杆菌,以Micro-Tom番茄叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化番茄,PCR检测、GUS染色和Real-time PCR检测表明,阔叶猕猴桃GalDH基因已整合到番茄基因组中。     

ω-3不饱和脂肪酸的生物学作用

由于人们的膳食中饱和脂肪酸 /多不饱和脂肪酸 (S/P)及 ω- 6不饱和脂肪酸 /ω- 3不饱和脂肪酸的比例失调 ,使得心血管的发病率显著增加。正因为 ω- 3不饱和脂肪酸的摄入量相对不足 ,所以人们更加重视ω- 3不饱和脂肪酸在脂肪酸促进胎儿和新生儿的大脑发育 ,抗肿瘤和炎性反应及降低冠心病、高血压、动脉粥样硬化、二型糖尿病等发病率的特殊作用 ,这些作用源于ω- 3的某些生物学作用。本文阐述 ω- 3功能活性的生物学作用基础     

不同种源臭椿果实内含物分析

以新疆鄯善、湖南浏阳、江西九江、甘肃天水和陕西汉中等5个种源地野外采集的臭椿果实为研究对象,分别测定臭椿果实中的内含物,鉴定其脂肪酸组成及各成分的分子式。结果表明,不同种源的臭椿果实中化学成分含量存在显著差异;脂肪酸成分相同,但各组分含量有差异。5个种源地的臭椿果实中都鉴定出10种脂肪酸且这10种脂肪酸碳链相对比较集中,主要在碳16到碳19之间。     

雌性阿根廷滑柔鱼性腺发育阶段的脂肪酸组成及其变化

阿根廷滑柔鱼是典型的头足类,资源生物量与其生长发育过程中营养物质积累及生殖投入密切相关。为了获知雌性阿根廷滑柔鱼性腺发育各阶段的脂肪酸组成及其变化特点,研究采用氯仿甲醇法和气相色谱法检测分析胴体、消化腺和卵巢的脂肪酸种类及其含量。结果表明,雌性阿根廷滑柔鱼胴体、消化腺和卵巢3个组织的脂肪酸均以多不饱和脂肪酸(PUFA)为主,饱和脂肪酸(SFA)次之,单不饱和脂肪酸(MUFA)的总含量最低。胴体组织的脂肪酸种类最全面,共检测出28种脂肪酸,消化腺和卵巢分别检测出21种和17种脂肪酸。检测发现3个组织中SFA均以C16∶0脂肪酸最为丰富,MUFA以C18∶1n9c和C20∶1脂肪酸为主,PUFA的DHA(C22∶6n3)最丰富,EPA(C20∶5n3)次之。胴体的SFA和MUFA在成熟期达到最大值,在产卵期显著降低;消化腺的PUFA保持相对稳定水平,但是其含量显著低于胴体和卵巢;卵巢持续积累脂肪酸,在产卵期时MUFA和PUFA显著降低。研究表明,雌性阿根廷滑柔鱼胴体、消化腺和性腺3个组织的脂肪酸种类具有组织特殊性,而主要脂肪酸具有一致性。性腺发育过程中,胴体的SFA和MUFA可能转化为能量供给卵巢发育,消化腺的PUFA则向胴体和卵巢转移,卵巢则持续积累脂肪酸供给卵子发生。     

GC-FID技术分析巫山淫羊藿种子休眠解除过程中脂肪酸含量变化

为了解巫山淫羊藿种子休眠解除与萌发过程中脂肪酸代谢特点,应用气相色谱法测定层积过程中巫山淫羊藿种子脂肪酸含量。结果表明:1)种子脂肪酸总量w为19.59%,其中饱和脂肪酸占3.28%,不饱和脂肪酸占16.31%;2)除低温层积种子亚麻酸含量逐渐增加外,各脂肪酸含量在低温或变温层积过程均逐渐减少;3)层积过程中脂肪酸含量与相对含量变化趋势不完全相同:低温层积中,油酸、亚油酸含量不断减少,但相对含量不断增加;变温层积中,亚油酸和亚麻酸含量不断减少,但相对含量不断增加;4)5mg/L氟啶酮浸种对低温层积种子脂肪酸代谢无显著影响,却可加速变温层积种子脂肪酸代谢,并使其萌发。本研究结果揭示了氟啶酮和层积温度对巫山淫羊藿种子休眠解除与脂肪酸代谢的影响,展示了种子休眠解除过程中各脂肪酸含量变化的关系。     

LED组合光谱对白羽肉鸡生长、屠宰性能及抗应激的影响

对野生及人工养殖瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分和营养品质进行了分析比较。结果表明,野生瓦氏黄颡鱼肌肉中水分显著高于人工养殖瓦氏黄颡鱼（P <0.05）,而粗脂肪含量显著低于人工养殖瓦氏黄颡鱼（P < 0.05）,粗蛋白和粗灰分含量两者无显著差异（P >0.05）。野生和人工养殖瓦氏黄颡鱼氨基酸组成基本一致,均含有17种以上氨基酸（色氨酸含量较低未测定）。除酪氨酸外,其余各项氨基酸指标均无显著差异（P>0.05）。氨基酸平衡性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼氨基酸组成符合FAO/WHO标准,具有较好的平衡性,蛋白品质较好。野生瓦氏黄颡鱼较养殖瓦氏黄颡鱼ω3脂肪酸高。瓦氏黄颡鱼肌肉贮存脂肪高,是一种较优的经济鱼类。     

3种海洋微藻ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达影响因素分析

研究了温度、光照和酸碱度对三角褐指藻、小球藻和球等鞭金藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因表达的影响。实时定量PCR结果表明,10和15℃的低温处理,降低了3种微藻ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达丰度,提高处理温度至25和30℃(三角褐指藻除外),则促进该基因的转录;在5 000 lx的光照强度下处理48和72 h,可以提高3种藻类的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的表达;酸碱度对3种微藻-ω3脂肪酸去饱和酶基因的表达影响与不同的物种有关,pH 5~9的培养结果显示,酸碱度对三角褐指藻影响较大,球等鞭金藻次之,而对小球藻影响较小。     

小鼠SOCS3基因真核表达载体的构建及其对3T3-L1细胞凋亡的影响

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和pEGFP-N1-SOCS3的核苷酸序列正确率为100%;在荧光显微镜下发现,脂质体组和SOCS3组均有GFP的表达;RT-PCR和Westernblotting检测表明,3T3-L1细胞中SOCS3mRNA表达显著提高(P<0.05);Hoechst 33258染色发现,SOCS3组的细胞凋亡显著;Bax和c-myc基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),bcl-2和mcl-1基因表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】SOCS3对脂肪细胞凋亡的发生有促进作用。     

ITGB1基因表达与鹅肥肝形成的关系

为探究ITGB1基因与鹅肥肝形成的关系,选取30只70日龄健康朗德公鹅,随机分为填饲组与对照组并进行24 d填饲.运用ITGB1基因序列进行生物信息学分析,采用RT-qPCR技术检测不同填饲阶段(填饲12d与24d)鹅肝脏中ITGB1基因的表达水平,同时,使用不同剂量的脂肪肝形成相关因子(胰岛素、葡萄糖、油酸、亚油酸和棕榈酸)处理鹅原代肝细胞,检测ITGB1基因的表达水平.结果 发现:全长CDS共2418 bp,编码805个氨基酸,与鸭的同源性高于98％,可编码1种亲水性蛋白;与对照相比,填饲12d与24 d时,鹅肝脏中ITGB1基因的表达均显著上调(P＜0.05);0.5 mmol·L-1油酸、亚油酸和棕榈酸均能显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.05);200mmol·L-1葡萄糖能极显著地诱导鹅原代肝细胞中ITGB1基因上调(P＜0.01);此外,0.2 mmol·L-1胰岛素也能在一定程度上有诱导其表达上调的趋势(P=0.098).结果 表明,ITGB1基因表达上调与鹅肥肝形成密切相关,受脂肪肝形成相关因子诱导,提示ITGB1基因表达上调可能会促进鹅肥肝的形成.     

宁夏小麦Glu-A3与Glu-B3位点等位变异组成分析

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。