油菜FAD2 基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种"中双9号"中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点p I值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体p BILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸(C18∶1)的含量从53.8%降低到12.4%~34.1%,亚油酸(C18∶2)含量从2.9%提高到11.5%~62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜Bn FAD2基因具有完整的催化功能。     

甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶(delta-12 oleate desaturase FAD2)基因的表达,从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻,达到富集油酸,减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择油菜fad2基因片段(510bp)分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子(83bp)及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301,植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus,从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶（delta-12 oleate desaturase FAD2）基因的表达，从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻，达到富集油酸，减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验，选择油菜fad2基因片段（510bp）分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游，并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子（83bp）及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2 RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301，植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus，从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

麻风树脂肪酸去饱和酶7基因的克隆及生物信息学分析

质体型ω-3(Δ15)脂肪酸去饱和酶(FAD7)是多不饱和脂肪酸合成途径中催化亚油酸(Δ9,12-C18∶2)形成α-亚麻酸(Δ9,12,15-C18∶3,ALA)的关键酶。基于麻风树低温锻炼转录组数据,通过逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆到麻风树FAD7基因的全长cDNA,命名为JcFAD7。结果表明,该cDNA序列全长1 796 bp,完整开放阅读框1 341 bp,编码446个氨基酸,理论分子量为51.1 ku,等电点为8.92。序列分析表明,JcFAD7编码蛋白包含膜结合FAD蛋白的4个跨膜区、2个膜嵌合区、1个亚铁血红素结合基序及3个组氨酸簇等特征区域。构建系统进化树显示,麻风树JcFAD7蛋白与芍药(Paeonia lactiflora)的亲缘关系最近。     

杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

[目的]w-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸(18∶1)去饱和形成亚油酸(18∶2),是多不饱和脂肪酸合成过程中的第一个关键酶。为了探究DsFAD2在盐藻油脂合成积累中的作用。[方法]本文以运城盐湖分离的富油杜氏盐藻(Dunaliella salina)株系(YC-011)为材料,利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因,并对DsFAD2编码蛋白进行了跨膜区、高级结构及氨基酸序列比对等一系列生物信息学分析。应用qRT-PCR检测DsFAD2基因在氮(N)胁迫培养条件下的表达模式。[结果]DsFAD2蛋白定位于内质网中,有5个跨膜区,具有典型膜结合蛋白的结构特征。此外,DsFAD2也具有所有FAD2蛋白家族所特有的3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列。系统发育分析发现杜氏盐藻DsFAD2与莱茵衣藻CrFAD2、团藻VcFAD2亲缘关系最近。qRT-PCR表明,与正常培养的杜氏盐藻相比,缺N培养显著诱导DsFAD2上调表达,N胁迫8d时DsFAD2的表达量是未胁迫对照的2.8倍。[结论]DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应,促进多不饱和脂肪酸形成,增强藻细胞抗逆性。本研究为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考。     

陆地棉脂肪酸去饱和酶基因GhFAD2-1的克隆与表达分析

Δ12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1是控制种子中单不饱和脂肪酸油酸(C18∶1)向多不饱和脂肪酸亚油酸(C18∶2)转化的关键基因,其表达水平决定植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花GhFAD2-1基因的深入研究有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。采用同源克隆技术获得棉花品种新陆早33号的GhFAD2-1基因,该基因编码区全长1 158 bp,共编码385个氨基酸;生物信息学分析结果表明,GhFAD2-1基因序列具有1个典型的FAD2结构域和1个FAD2-N端结构,其氨基酸序列与橄榄、芝麻、花生、油茶等作物的FAD2序列相似性较高,在75%～78%之间。利用qRT-PCR技术分析发现,GhFAD2-1基因的表达量随着棉籽的发育呈先升高后降低的趋势,开花后40 d达到其表达峰值。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定其脂肪酸组成,结果表明,开花后0～40 d,C18∶1含量/C18∶2含量与GhFAD2-1基因表达量变化趋势相反。     

转基因高油酸甘蓝型油菜新种质的获得

在获得转fad2基因ihpRNA的甘蓝型油菜的基础上,应用气相色谱技术分析了转基因株系W-4(T_1代)单株自交种子(T_2代)的脂肪酸组成.结果显示:由49个单株组成的T:代群体油酸(C_(18:1))含量变幅为55.87%84.73%,其中有19个(占38.8%)单株种子油酸含量大于75%,有11个(占22.4%)单株种子油酸含量大于80%;受体(对照)的油酸含量变幅为55.28%～67.43%;获得的转基因高油酸材料(油酸含量≥75%)种子中亚油酸(C_(18:2))和亚麻酸(C(18:3))含量明显低于受体;高油酸材料的油酸脱饱和指数ODP值为5%~12%,而受体的ODP值高达20%～36%.基于ODP值,可以推测转基因高油酸材料种子中的FAD2活性受到有效抑制,从而阻止了油酸向亚油酸、亚麻酸的合成.     

油用向日葵脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1的克隆与表达分析

为了解FAD2-1基因在油用向日葵品质形成过程中的作用,以油用向日葵为材料,利用RT-PCR方法对高含油率保持系材料改HA89(含油率为46%)和低含油率保持系材料86-1(含油率为38%)的脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1进行克隆与表达分析。结果表明:获得了脂肪酸脱氢酶基因FAD2-1全长cDNA编码序列,全长为1 137bp,编码378个氨基酸。核苷酸序列和蛋白序列比对结果表明,该基因在这2份材料中第44位和第102位核苷酸存在差异,并且都导致了氨基酸的改变。种子发育不同阶段油酸和亚油酸积累动态分析和qRT-PCR研究结果表明,FAD2-1基因表达量变化趋势与亚油酸含量变化趋势基本一致,而与油酸含量变化趋势基本相反。     

油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定

为研究油葵FAD2-1基因在脂肪酸合成中的催化功能,利用RT-PCR技术,从油葵品种新葵杂4号未成熟种子中克隆HaFAD2-1基因的全长cDNA序列。将该基因序列构建穿梭表达载体pYES2-HaFAD2-1,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中。将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行GC-MS分析。结果显示,HaFAD2-1基因编码一个长378个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子质量43 719,等电点(pI)为8.38,具有3个高度保守的组氨酸簇。脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明HaFAD2-1基因在酿酒酵母中获得表达,能将油酸转化为亚油酸,证明克隆得到的HaFAD2-1具有完整的催化功能。     

红花油酸去饱和酶基因的克隆及序列分析

【目的】对红花油酸去饱和酶FAD2基因进行克隆和生物信息学分析,为深入研究该酶的功能提供理论依据。【方法】提取红花种子总RNA,通过RT-PCR方法进行反转录,PCR扩增得到FAD2基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法,对红花FAD2氨基酸序列的理化性质、系统进化、蛋白定位和跨膜区域等进行预测和分析。【结果】成功克隆获得了红花FAD2基因,其开放阅读框cDNA长1 140bp,编码380个氨基酸,预测分子质量43.6ku,理论等电点8.37,带有正电残基(强酸性)30个、负电残基(强碱性)34个。FAD2蛋白含有3个极度保守的His-Box,不存在明显的信号肽,存在6个跨膜结构域,与疏水区域预测结果一致。红花FAD2核苷酸的分子进化树分析显示,其与日本栽培稻的亲缘关系较近。红花FAD2氨基酸序列比对结果表明,不同植物的FAD2具有较高的同源性,同源性平均达72.94%。【结论】成功克隆了红花FAD2基因,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。     

文冠果籽油的索式萃取及其组成分析

[目的]研究萃取文冠果籽油的最佳工艺条件,分析文冠果籽油的组成。[方法]以文冠果仁为原料,采用索氏萃取法萃取文冠果籽油。通过单因素试验研究萃取文冠果籽油的工艺条件,考察溶剂种类、液料比、萃取回流次数等因素对文冠果籽油萃取率的影响。采用GC-MS方法分析文冠果籽油的组成。[结果]索氏法萃取文冠果籽油的最佳工艺参数是：较合适的溶剂为乙醚,最佳液料比为5∶1（ml∶g）,适宜的萃取回流次数为5次,在此条件下,文冠果籽油的萃取率为46.0%。文冠果籽油的主要成分为油酸、亚油酸、油菜酸和棕榈酸等。[结论]文冠果籽油中不饱和脂肪酸含量高达86%,其种类比花生油和橄榄油更多,其中首次发现存在11,14-二十碳二烯酸,表明其作为高级食用油具有的良好前景。     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

Cloning and Molecular Identification of A Fatty Acid Desaturase 2 Gene in a and C Genome of Brassica Species

The fatty acid desaturase 2 (fad2) gene was proven to be a major locus for high oleic acid (C18:1). Brassica napus is an amphidiploid species originating from a spontaneous hybridization of Brassica rapa and Brassica oleracea. B. napus contains multiple copies in genome for most of the genes, including fad2 genes. The research cloned nine fad2 genes from 3 varieties of B. rapa and 3 varieties of B. oleracea, respectively. Alignment of the nine fad2 sequences from B. rapa and B. oleracea detect-ed 6 single nucleotide polymorphic sites, which resulted in 6 amino-acid substitutions. The nucleotide substitutions at position 743 bp in the fad2-A gene and position 947 bp in the fad2-C gene were used as 3’ end of al ele-specific primers. In use of the al-lele-specific primers to amplify fad2 gene, we could identify if the fad2 gene originated from A genome or C genome. Besides, the research found that fad2 genes in C genome are more conserved in evolutionary process than those in A genome. The fad2 expression data reported in this study revealed that fad2-A from B. rapa was not only expressed in siliques same as fad2-C from B. oleracea, but also expressed in a high level in stems. Not even the less, fad2 gene from B. napus was expressed higher in roots and flowers. Al these results provided evidences that fad2, though it was expressed differently in B. rapa and B. oleracea, but it was regulated by the same approach in B. napus.     

‘航花2号’的Δ~(12)脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的生物信息学分析

植物中的Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是油酸形成亚油酸的关键酶。通过NCBI和EXPASY 2大数据库,采用Signal P、TMHMM、Psort、Prot Param和Target P等分析程序对花生品种‘航花2号’及其它物种的19个FAD2蛋白序列进行分析,利用MEGA6.0软件比对序列及构建系统进化树阐明FAD2基因的系统发育关系,亲缘相近的FAD2蛋白聚在一起。预测了‘航花2号’和‘粤油13’的FAD2蛋白的分子质量、等电点、信号肽、跨膜和保守结构域等。结果表明:‘航花2号’FAD2蛋白的N端没有信号肽,预测定位在微体、细胞质、线粒体基质和叶绿体类囊膜中,而C端信号基序LKGL使得FAD2蛋白选择性地结合和嵌入内质网,植物的FAD2蛋白普遍有3个高度保守的组氨酸富集基序(HECGHH、HRRHH和H[A/C/T]HH)和3~5个跨膜结构,但分析结果显示,‘航花2号’的FAD2蛋白的H[A/C/T]HH的组氨酸基序是缺失的,而油酸转化为亚油酸的效率上并没有显著变化,为将来FAD2基因的基因工程操作提供一定的理论基础。     

航天诱变高油酸甘蓝型油菜突变体分子标记的筛选

【目的】利用与候选基因FAD2紧密连锁的SSR标记对航天诱变的高油酸F2群体进行SSR标记分析,筛选与该高油酸性状紧密连锁的SSR标记及分析其突变位点。【方法】F2群体母本10L421为黄籽低油酸高亚麻酸自交系,父本10L422为航天诱变的高油酸低亚麻酸的突变株自交系后代。对4条染色体（A05、A01、C05及C01）上的候选基因FAD2上下游100 kb区域设计的148对SSR引物在两亲本、高低油酸混合池及F2群体中进行分析。亲本及群体油酸含量采用气相色谱分析,根据分子标记结果对F2群体油酸含量进行单标记分析。【结果】有36对引物在亲本间表现多态性,多态频率为24%。其中10对SSR引物在2个亲本和高油酸、低油酸极端群体间均具有相同的多态性。显著性检验和单标记分析表明,A05和A01上与FAD2共分离的SSR标记在0.01显著水平上与油酸性状相关,单标记分析分别解释表型变异31.1%和29.4%。【结论】A05和A01染色体上的FAD2是控制该突变体材料高油酸性状变异的主效位点,且该高油酸突变体是由于A05和A01上FAD2的双隐性突变所致。     

缺刻缘绿藻Δ15脂肪酸去饱和酶的功能分析

缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa Reisigl）是一种富含多不饱和脂肪酸的球形单细胞淡水绿藻。在脂肪酸合成途径中,脂肪酸去饱和酶与脂肪酸酰基结合载体结合进行脂肪酸去饱和反应。为探究与缺刻缘绿藻中?15脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase,FAD）结合的脂肪酸酰基结合载体,选用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1和聚球藻（Synechococcus sp.）PCC7942分别验证?15 FAD与酰基辅酶A（酰基-CoA）或酰基载体蛋白（酰基-ACP）结合的脂肪酸去饱和过程。根据缺刻缘绿藻的?15 FAD基因构建双源表达载体pYES2-?15 FAD和pCAMBIA1300-?15 FAD,通过电穿孔法将重组表达质粒分别转入酿酒酵母INVSc1和聚球藻PCC7942中,筛选得到转基因菌株。取相同细胞数的转基因酵母和转基因聚球藻,培养时分别添加等量的底物亚油酸（linoleic acid,18:2?9,12,LA）,以LA作为酰基受体,使其进入转基因酵母和转基因聚球藻的生物合成途径中,培养36-72 h。利用气相色谱-质谱联用系统对总脂肪酸的各组分进行分析,结果显示,在转基因实验组中检测到LA和?-亚麻酸（?-linolenic acid,18:3?9,12,15 ,ALA）的存在,空白实验则未检测出相应的产物。通过计算,转基因酵母催化LA生成ALA的效率29.31%,转基因聚球藻催化底物LA生成ALA的效率为30.86%。根据结果证明无论是酰基-ACP还是酰基-CoA,与缺刻缘绿藻中的?15 FAD结合进行反应的效率相近,不存在偏好性,由于?15 FAD是特异性蛋白,因此证明缺刻缘绿藻中的?15 FAD属于脂酰基结合蛋白。     

黄瓜种子脂肪酸含量与耐低温性关系的研究

[目的]探讨黄瓜种子脂肪酸含量、种类与耐低温性的关系。[方法]对15份不同来源的黄瓜材料进行白天12℃,晚上8℃的低温处理,每天光照7.5 h,处理14 d,对黄瓜的耐寒性进行分级,并计算耐寒指数,测定供试黄瓜种子的含油量、脂肪酸成分及含量。[结果]黄瓜种子的脂肪酸主要有棕榈酸(16∶0)、棕榈烯酸(16∶1)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3),与其耐寒指数进行相关分析发现,耐寒指数与亚油酸、亚麻酸含量、种子含油量I、UFA(不饱和度)达显著正相关,与棕榈酸含量、棕榈烯酸含量、硬脂酸含量相关系数很小,各材料的油酸含量基本相同。[结论]黄瓜的亚油酸、亚麻酸、种子含油量I、UFA与黄瓜的耐低温性有密切的关系。     

滩羊脂肪中脂肪酸组成的研究

肉羊体脂脂肪酸是影响肉品风味和膻味的重要因素之一。利用HP6890型气相色谱仪,对2个年龄阶段滩羊的肾脏脂肪、背膘脂肪和尾部脂肪做了测定,分析了滩羊的三个不同部位脂肪组织中的脂肪酸组成及其特点,以及决定滩羊肉脂肪组织风味的主要因素。从分析结果中可知,滩羊脂肪中主要脂肪酸组成即豆寇酸(14:0)、软脂酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、亚麻酸(18:3)等6种脂肪酸的累计组成占总脂肪酸的88.37 %~97.41 %。其中除豆寇酸(14:0)和硬脂酸(18:0)组成在年龄间差异显著外(P<0.05),其它脂肪酸含量均较稳定。     

10个不同品种的薄壳山核桃脂肪含量及脂肪酸组成分析

以10个不同品种薄壳山核桃Carya illinoensis为试材,采用气相色谱法,测定不同品种的薄壳山核桃的脂肪相对含量及脂肪酸组成成分。测定结果表明:核桃仁中的脂肪相对含量为69.11%～78.19%,出仁率为36.79%～59.47%,脂肪中不饱和脂肪酸＞90.00%,其中以油酸最高,其次是亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸、花生酸,且油酸和亚油酸存在极显著负相关关系（P＜0.01）,不同品种的薄壳山核桃油脂肪酸组成相同,但脂肪酸相对含量有显著差异（P＜0.05）,其单不饱和脂肪酸（油酸）相对含量为73.01%～58.76%;多不饱和脂肪酸以亚油酸为主,相对含量为32.20%～19.69%,且出油率与出仁率呈极显著的正相关关系（P＜0.01）,同出籽率和果皮厚度没有明显的关系。图3 表3 参12