鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

青鳉组织蛋白酶E基因全长cDNA克隆与功能预测

利用反转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术克隆青鳉(Oryzias latipes)肠道组织蛋白酶E(cathepsin E,CtpE)基因全长cDNA序列,并分析青鳉组织蛋白酶(OlCtpE)的功能。结果显示:OlCtpE基因cDNA(GenBank登录号:KP864679)全长1 301 bp,其中5'端非翻译区24 bp,3'端非翻译区56 bp,开放阅读框1 221 bp,编码406个氨基酸;OlCtpE蛋白N端含有一个由17个氨基酸组成的信号肽,属于分泌蛋白;同源比对显示,OlCtpE蛋白由2个以活性位点"DTGT"为催化中心的同源结构域组成,对称分布的2个保守的催化中心形成"催化二联体";三级结构分析显示,负责底物固定的"活性中心翼环"延伸到活性部位上,活性部位的发夹式裂隙可以为底物与酶的契合提供空间。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

虹鳟鱼trapd基因cDNA的克隆与序列特征分析

易位子相关蛋白δ(translocon associated protein delta,TRAPD)是作为内质网膜蛋白参与细胞内信号序列识别、新生肽链的修饰、转运通道的形成等过程.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,采用RT-PCR和RACE法分离和克隆虹鳟鱼trapd基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591154),序列全长949 bp,其中5'端非翻译区(UTR)长109 bp,3'端非翻译区(UTR)长336 bp,开放性阅读框(ORF)长504 bp,编码167个氨基酸,存在1个跨膜区.虹鳟TRAPD蛋白序列与斑马鱼、黑青斑河豚、大西洋鲑、斑点叉尾鲴、热带爪蟾、人和小鼠等脊椎动物的同源性均在80%左右,表明trapd基因在进化过程中是高度保守的.     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

二色补血草凝集素（Lectin）序列分析及表达

从二色补血草cDNA文库中分离出一个凝集素(Lectin)基因全长cDNA序列.该基因全长977 bp.其中:5′非翻译区(UTR)103 bp,3′非翻译区(UTR)208 bp,开放阅读框(ORF)全长663 bp,编码由221个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为25 kD,理论等电点为8.82.利用实时定量RT-PCT方法进一步研究了二色补血草在植物病原菌(尖孢镰刀菌)侵染条件下不同时间点该基因的表达情况.结果表明,在尖孢镰刀菌胁迫处理的条件下,能诱导Lectin基因在二色补血草的根、叶中表达,说明该基因与植物抗病相关.     

虹鳟冷休克蛋白Y-box基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用逆转录PCR(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑组织中克隆了Y-box基因cDNA全长序列(GenBank登录号:FJ492962)。该基因cDNA全长为1 452 bp,其中5'端非翻译区(5'UTR)长137 bp,3'端非翻译区(3'UTR)长409 bp,开放阅读框(ORF)长906 bp,编码301个氨基酸。蛋白质相对分子质量为33.1×103。PSORTⅡ亚细胞定位显示该蛋白位于细胞核,富含两类核定位信号,分别为pat4与pat7。虹鳟的Y-box蛋白序列与大西洋鲑、斑马鱼和大菱鲆的同源性分别为99%、80%和79%。同源建模显示虹鳟与人的Y-box蛋白具有十分相似的三级结构。系统发育树显示不同物种的Y-box蛋白分为3个亚群:亚群Ⅰ为鱼类;亚群Ⅱ为两栖类、鸟类及哺乳类;亚群Ⅲ为节肢动物类,这与物种间的进化历程基本一致。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

苎麻ACC氧化酶基因（BnACO1）的克隆及表达

【目的】克隆苎麻中的一个ACO基因（BnACO1）,并对其进行生物信息学分析、表达分析、胁迫应答分析。【方法】通过RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆该基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析。利用实时荧光定量PCR分析BnACO1在苎麻不同部位的表达量以及在ABA、干旱和高盐胁迫下的应答。【结果】BnACO1的cDNA序列全长为1 476 bp,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点分别为36.81 kD和4.95,基因登录号为JX878855。与无花果（AB307720）、香叶天竺葵（U19856）、柿树（AB073009）、梨（JN807390）、猕猴桃（HQ293208）的ACO基因核苷酸序列相似性分别为83%、81%、79%、79%和79%,氨基酸序列的相似性分别为87%、80%、80%、78%和83%。实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。【结论】获得的BnACO1是ACO家族成员之一,参与ABA、干旱、NaCl胁迫应答,该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L^-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC₂烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因的克隆与表达模式分析

摘要[目的]克隆西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum La3xm．）乙二醛酶Ⅱ基因并了解该基因表达模式。[方法]应用RACE技术和实时荧光定量PCR技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的乙二醛酶Ⅱ基因的cDNA序列,并对该基因在不同胁迫时间、不同组织的表达差异进行了比较。[结果]克隆的乙二醛酶Ⅱ基因cDNA为890bp,其中开放读码框为765bp,编码254个氨基酸,5’非翻译区为49bp,3’非翻译区为72bp,GenBank中登录号为HM241910。序列比对分析结果表明,该基因编码的乙二醛酶Ⅱ与乙二醛酶Ⅱ三型匹配最佳,并具备乙二醛酶Ⅱ的GloB、ComEC和Lactamase,B等结构域。实时荧光定量PCR分析显示,乙二醛酶II基因在正常生长的西伯利亚蓼地下茎、茎与叶中都有表达,其中茎的表达量最高。同时,乙二醛酶Ⅱ基因受3％NaHCO,胁迫诱导,其在不同部位的表达模式有差异。[结论]克隆了西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因并初步阐明了其表达模式。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。