普通小麦转录因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

【目的】非生物逆境是制约小麦生产的主要因素。WRKY转录因子是植物特有的转录因子家族,参与对多种非生物逆境胁迫的应答。普通小麦基因组中至少含有200个WRKY,目前仅对少数成员的功能进行了鉴定。通过克隆小麦WRKY转录因子TaWRKY35并揭示其功能,为改良小麦的抗逆性提供基因资源。【方法】利用小麦全长cDNA数据信息,从强抗旱小麦品种旱选10号中克隆逆境胁迫应答转录因子基因TaWRKY35;采用实时定量PCR技术,分析目标基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达水平,以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低温等逆境胁迫下的表达模式;构建目标基因与GFP融合的表达载体,转化小麦原生质体,以确定目标蛋白在细胞中的作用位置;构建TaWRKY35过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,揭示目标基因的功能。【结果】TaWRKY35的开放阅读框全长1 134 bp,编码377个氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一个典型的WRKY结构域,C端有一个C₂HC型的锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅲ亚家族。测序发现TaWRKY35编码区序列非常保守,在32份多态性较高的六倍体小麦材料中未检测到DNA多态性。TaWRKY35在小麦的不同发育时期、不同组织中均有表达,其中在幼苗根基部表达量最高,约为苗期叶片中表达量的26倍;其次为幼芽根基,约为苗期叶片中表达量的21倍;接下来依次为孕穗期茎节、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期叶片,而在幼苗叶片中表达水平最低;同时在ABA、NaCl、PEG和低温胁迫条件下,小麦幼苗TaWRKY35的表达量均显著上升,表明TaWRKY35参与对4种逆境胁迫的应答,但在不同胁迫条件下表达模式差异显著,其中对盐胁迫最敏感。亚细胞定位发现,TaWRKY35特异定位在细胞核上,是典型的核定位蛋白。在高盐胁迫条件下,TaWRKY35过表达转基因拟南芥子叶白化率显著低于对照,TaWRKY35过表达转基因拟南芥的细胞膜稳定性和幼苗存活率均显著高于野生型对照,表明TaWRKY35能增强植物的耐盐性。【结论】TaWRKY35编码蛋白含有WRKY和C₂HC结构域,为WRKY家族第Ⅲ亚家族成员。TaWRKY35在小麦发育的不同时期、不同组织中均有表达,且受ABA、PEG、NaCl及低温等逆境胁迫诱导。过表达TaWRKY35能显著提高转基因拟南芥的耐盐性。     

小麦锌指转录因子TaDi19A对低温的响应及其互作蛋白的筛选

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Net Phos 2.0 Server数据库预测Ta Di19A蛋白磷酸化位点。以低温处理的小麦c DNA作为模板,通过SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR,检测Ta Di19A在低温处理不同时间段的表达模式。构建植物表达载体p BI121-Ta Di19A,通过花序侵染法转化拟南芥,用T3代拟南芥进行耐冷性鉴定,分析低温处理对转基因拟南芥的根长、鲜重和存活率的影响。检测转Ta Di19A拟南芥中抗逆相关基因表达变化,分析Ta Di19A调控植物耐冷性的作用机制。构建诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,将诱饵载体p GBKT7-Ta Di19A和小麦c DNA文库共转化酵母AH109感受态细胞,通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,测序和BLAST分析获得候选蛋白。【结果】小麦Ta Di19A编码区全长747 bp,编码248个氨基酸,分子量为28.03 k D,等电点为4.74,基因含4个外显子,3个内含子。Ta Di19A蛋白靠近N-端包含锌指结合结构域,C端为Di19结构域,预测的Ta Di19A蛋白三级结构包含2个α螺旋结构。磷酸化位点分析结果显示Ta Di19A蛋白含有12个丝氨酸、9个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR结果显示,Ta Di19A受低温胁迫诱导表达。正常生长条件下,转基因和野生型拟南芥没有明显差异,低温处理下,转基因拟南芥的根长明显大于野生型拟南芥,并且耐冷性强于野生型拟南芥。下游基因检测结果表明,低温处理后,CBL1、CBL2和KIN1等冷胁迫响应相关基因在野生型和转基因植株中表达量都升高,在转基因植株中的表达量显著高于野生型,表明Ta Di19A可能通过调节下游冷胁迫响应相关基因的表达提高转基因植物的耐冷性。通过对酵母双杂交系统筛选到的候选互作蛋白进行初步分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导和非生物胁迫响应过程,表明Ta Di19A在植物的逆境信号转导及非生物胁迫响应过程中发挥着重要作用。【结论】小麦Ta Di19A受低温诱导表达,过表达能够提高转基因拟南芥的耐冷性;而Ta Di19A功能的发挥可能需要其他蛋白的参与。     

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。     

普通小麦TaGNOM1的分子鉴定和表达分析

【目的】初步了解GNOM1基因在小麦中的可能的功能。【方法】对小麦同源基因TaGNOM1进行了结构、启动子调控区、组织特异性表达以及非生物胁迫表达等进行了分析,同时利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)在"中国春"中对该基因的表达模式进行了验证。【结果】TaGNOM1位于小麦第4同源染色体群(4A、4B和4D),其基因结构一致,包含1个内含子和2个外显子。在所研究的物种中除大麦外,均包含有保守的功能域(Sec7)。组织特异性表达分析表明,与其他组织相比GNOM1基因在小麦的穗、茎和根部,水稻的花药、穗及根部,以及大麦的花序轴表达更为丰富。公共数据库和RT-qPCR分析结果表明小麦TaGNOM1在高盐处理下,表达量受到正向调控;而在低温、ABA、干旱和高温处理下,受到负向调控。这些结果表明该基因可能参与小麦非生物逆境胁迫的调控。【结论】拓宽了对TaGNOM1基因的认识,对进一步研究其在小麦中的生物学功能提供了参考信息。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。     

小麦NPR1基因家族鉴定及其表达分析

【目的】对小麦NPR1基因家族成员进行鉴定及表达分析,为探究该家族基因的作用机制及小麦遗传改良提供理论参考。【方法】以拟南芥NPR1家族蛋白序列为参考序列,从小麦基因组中鉴定出小麦NPR1基因家族成员,利用生物信息学软件对其序列特征进行分析,并分别利用RNA-Seq原始数据和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析小麦NPR1家族基因在不同组织及不同胁迫下的表达水平。通过STRING在线网站构建TaNPR1s蛋白的互作网络。【结果】共鉴定获得20个小麦NPR1基因家族成员,其编码蛋白的不稳定指数均大于40,为不稳定蛋白;平均总亲水性值（GRAVY）均为负值（除TaNPR5-D为正值外）,为亲水蛋白;主要分布于细胞核内,在叶绿体、线粒体、内质网和细胞质等部位也有分布;二级结构均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规卷曲组成,以α-螺旋和无规则卷曲为主;对应的三级结构模型有10种。20个TaNPR1s蛋白均可与转录因子HBP-1b及未知蛋白A、B、C、D发生相互作用,这5种蛋白均含有bZIP结构域（含TGACG基序）和种子休眠特异基因结构域（DOG1）。TaNPR1s基因在不同组织中的表达模式不同,可分为在多个组织中表达、在特定的组织或发育阶段表达和在不同组织发育阶段均低表达或不表达,共三大类。随机挑选的8个TaNPR1s基因中,有3个基因在禾谷镰刀菌胁迫下表达量降低,但在白粉病菌胁迫下表达量升高;有2个基因在这两种菌胁迫下表达量均升高,有2个基因在两种菌胁迫下表达量均下降。TaNPR1s基因对6种非生物胁迫处理均有响应,但表达模式存在差异。【结论】小麦NPR1基因家族成员在不同组织生长发育过程和生物和非生物胁迫响应中发挥重要调控作用,且基因的可变剪接体也表现出不同组织表达特性,丰富了NPR1s蛋白功能。TaNPR1s蛋白可能通过与bZIP和DOG1结构域结合发挥其生物学功能。     

蓖麻RcFEN1基因克隆及非生物胁迫下表达模式分析

【目的】克隆蓖麻结构特异性核酸酶1基因(RcFEN1),并检测其组织表达特性及不同非生物胁迫下的时空表达模式,为揭示RcFEN1基因在蓖麻生长发育和响应低温胁迫等非生物胁迫的功能提供理论参考。【方法】根据蓖麻低温胁迫转录组注释信息,通过RT-PCR对RcFEN1基因编码区(CDS)进行克隆,利用生物信息学软件进行序列特征分析,并利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测其组织表达特性及不同非生物胁迫下的时空表达模式。【结果】克隆获得的RcFEN1基因(GenBank登录号OP205366)包含1个1154 bp的开放阅读框(ORF),编码383个氨基酸残基,含有RAD2/XPG核酸酶蛋白家族典型的结构域XPG-N和XPG-I,属于RAD2/XPG蛋白家族成员。RcFEN1蛋白含多个生物活性位点及功能区,但无跨膜区域和信号肽结构,是一个非分泌型亲水蛋白,定位在细胞核。RcFEN1蛋白与特洛花TsFEN1蛋白的氨基酸序列一致性最高,与大叶藻ZmFEN1蛋白序列的一致性最低,分别为90.28%和84.32%。RcFEN1蛋白与一串红和硬皮地星的FEN1蛋白亲缘关系较近。RcFEN1基因在子叶中的相对表达量显著高于根、茎和真叶(P<0.05,下同),在真叶中的相对表达量最低。RcFEN1基因在4种非生物胁迫下均有表达,但表达模式存在明显差异,其中,RcFEN1基因对干旱胁迫响应最敏感,处理2和4 h时相对表达量显著高于对照组(0 h)及其他处理时间;RcFEN1基因在盐胁迫和ABA胁迫下呈现相同的响应表达模式,均在处理4 h时开始表达,随后相对表达量降低;在低温胁迫下,RcFEN1基因在低温胁迫下延迟表达,且处理12 h后才被激活表达,且相对表达量持续增加。【结论】从蓖麻中克隆获得RcFEN1基因属于RAD2/XPG家族成员,是蓖麻低温胁迫下的差异表达基因,参与蓖麻低温胁迫的响应调控。     

小麦脱水素基因TaDHN-1的特征及其对非生物胁迫响应

【目的】分析小麦脱水素基因特征及其在干旱、高盐、低温和高温胁迫过程中的表达模式,探讨脱水素在小麦抗逆过程中的功能,为脱水素基因在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR克隆小麦脱水素基因,通过生物信息学分析研究其编码蛋白特征;采用qRT-PCR分析该基因表达特性模式。【结果】克隆了包含完整编码区的小麦脱水素基因TaDHN-1,序列分析显示该基因cDNA长487 bp,编码112个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为11.5 kD,等电点为6.6。氨基酸序列分析表明,TaDHN-1在C端具有保守的K片段,属于Kn类脱水素;二级结构预测显示,该脱水素无规则卷曲占整个蛋白的82.1%,具有很高的亲水性;PredictProtein预测显示,该脱水素无跨膜区域,亚细胞定位于细胞质中。表达特性分析表明,TaDHN-1受植物激素ABA的诱导;在干旱、高盐和低温胁迫条件下,该基因均受胁迫的诱导而表达上调,但对42℃高温胁迫不敏感;在种子发育过程中,TaDHN-1的表达呈下调趋势,且在种子发育后期的表达量极低,推测TaDHN-1不参与小麦种子成熟后期的脱水保护过程。【结论】小麦脱水素基因TaDHN-1属于脱水素基因家族的Kn亚类。该基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应路径发挥功能,可能参与了小麦对干旱、高盐和低温胁迫的耐受调节过程,但对高温胁迫不敏感,也未参与种子发育后期的脱水保护过程。     

水稻 OsbHLH109 基因的表达分析

【目的】bHLH 转录因子家族是真核生物中重要的转录因子家族,在植物生长发育、次生代谢和逆境应答中发挥重要作用。分析水稻（Oryza sativa L.）bHLH 转录因子基因 OsbHLH109（LOC_Os01g67480）对逆境胁迫和激素的响应模式,为进一步研究 OsbHLH109 在逆境胁迫和激素响应过程中的功能提供理论依据。【方法】对 OsbHLH109 进行生物信息学分析,同时利用定量 PCR（qRT-PCR）技术分析 OsbHLH109 在水稻品种中花 11 不同组织、不同激素和非生物胁迫处理下的表达模式。【结果】OsbHLH109 编码区全长为 1 164 bp,包含 6 个外显子,编码 388 个氨基酸,是一个含有 HLH 保守结构域的 bHLH 转录因子。系统进化分析显示,OsbHLH109 与玉米等单子叶植物中的同源蛋白亲缘关系较近,与双子叶植物中的同源蛋白亲缘关系相对较远。顺式作用元件分析表明,OsbHLH109 的启动子区含有 24 个植物激素响应元件和 25 个环境胁迫响应元件。qRT-PCR 分析表明,OsbHLH109 在水稻根、茎、叶和幼穗等组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高;激素和非生物胁迫处理结果表明,叶片中 OsbHLH109 对细胞分裂素（6-Benzylaminopurine, 6-BA）、生长素（Indole acetic acid, IAA）、赤霉素（Gibberellic acid, GA3）、脱落酸（Abscisic acid, ABA）等激素处理的响应表达均达到显著差异水平;且叶片中 OsbHLH109 在低温、干旱、高温、盐胁迫等逆境处理的响应表达均达到显著差异水平,表明 OsbHLH109 的表达受 6-BA、IAA、GA3、ABA、高温、低温、PEG6000 和 NaCl 的诱导,推测其在水稻非生物胁迫响应过程中具有重要作用。【结论】水稻 OsbHLH109 为 bHLH 转录因子家族成员,主要在叶片中高表达,OsbHLH109 基因的表达受高温、低温、盐害等外界因素调控,同时响应 6-BA、IAA、GA3、ABA 等激素信号,推测其可能通过 ABA 等激素信号转导途径参与水稻的非生物胁迫响应。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

橡胶树转录因子HbERF1的克隆与功能分析

【目的】克隆橡胶树转录因子HbERF1,分析其在橡胶树中响应非生物胁迫的表达模式,并通过在拟南芥中过表达鉴定其生物学功能,为橡胶树抗逆育种提供基因储备。【方法】利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到HbERF1全长序列,通过qRT-PCR技术分析其在非生物胁迫下的时空表达特性;通过农杆菌介导法转化拟南芥,利用Southern杂交和qRT-PCR技术对过表达植株进行鉴定,并分析过表达植株在干旱、高盐和PEG等胁迫条件下的表型及相关基因的表达特性,验证HbERF1的生物学功能。【结果】橡胶树转录因子HbERF1没有内含子,GenBank登录号为JQ914647,cDNA序列全长为1 178 bp,包括62 bp的5'非编码区、474 bp的3'非编码区和642 bp的开放阅读框。开放阅读框编码一条213个氨基酸组成的多肽,该蛋白具有一个保守的AP2结构域和一个EAR基序。系统进化分析表明,HbERF1属于AP2/ERF家族中ERF亚族的B-1类,与蓖麻RcERF、杨树PtERF46、拟南芥AtERF4的一致性最高,分别为72%、62%和61%。qRT-PCR分析表明,HbERF1在橡胶树叶片和树皮中均能响应高盐、干旱和PEG胁迫,基因的表达在叶片中受ABA、MeJA的抑制,而在树皮中则受ABA、MeJA和SA的抑制。在高盐和PEG胁迫下,叶片中的HbERF1在处理前期（≤8 h）表达水平都低于对照,而树皮中的HbERF1在胁迫4 h时就受到强烈诱导。在干旱胁迫下,随着干旱程度的增加,HbERF1在叶片和树皮中表达水平持续增加,且在树皮中的表达要高于叶片中的表达。HbERF1的过表达提高了拟南芥的抗旱性、耐盐性和耐PEG胁迫的能力,并抑制了乙烯受体基因AtETR1和AtERS1的表达。在过表达植株中,AtETR1和AtERS1的表达水平分别比野生型中的降低了19倍和9倍,差异极显著（P＜0.01）。在高盐胁迫下,过表达植株中AtRD22和AtRD29A的表达水平持续上升,且上调幅度高于WT,分别为对照的115倍和100倍;在20% PEG胁迫下,AtRD22和AtRD29A的表达都受到诱导。用300 mmol•L-1NaCl浇灌拟南芥,处理15 d后,野生型拟南芥的叶片几乎全部萎蔫白化,而过表达株系S1仅有少数叶片萎蔫白化。用20% PEG6000水溶液浇灌拟南芥,处理15 d后,过表达株系S1生长正常,已进入生殖生长,而野生型植株仍保持在营养生长阶段,生殖生长被延迟,且部分叶片出现脱水现象。停止浇水2周后,野生型拟南芥植株叶片枯萎程度高于过表达植株,复水1周后野生型植株的存活率仅为35.0%,而过表达植株的存活率则高达95.0%。【结论】HbERF1参与了橡胶树的ABA、JA、SA和ETH信号途径,是ETH信号的正调控因子,对提高橡胶树的耐旱性具有积极作用。     

小麦K2型脱水蛋白DHN14响应非生物胁迫的功能分析

【目的】研究脱水蛋白DHN14的功能及其在植物响应非生物胁迫中的潜在作用。【方法】从小麦品种"郑引1号"克隆获得脱水蛋白基因DHN14,对其进行生物信息学分析,利用实时定量PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达水平,构建脱水蛋白DHN14基因的原核表达载体(重组菌pET28a-DHN14),经IPTG诱导表达后,在非生物胁迫下,研究该蛋白对大肠杆菌及乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用。【结果】克隆获得脱水蛋白基因DHN14的CDS为339 bp,编码112个氨基酸,该蛋白含有2个保守的K片段,属于高亲水性无序蛋白,其分子质量为24 ku,等电点(pI)约为6.28;多序列比对分析表明,DHN14蛋白与WCOR726(Triticum aestivum)脱水蛋白的亲缘关系最近;实时定量RT-PCR结果表明,脱水蛋白基因DHN14受干旱、低温和ABA诱导表达;在20 mmol/L金属离子(Co~(2+)、Ni~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))胁迫下,表达DHN14重组蛋白的大肠杆菌的活力明显高于对照,表明该蛋白在大肠杆菌中对金属离子胁迫具有保护作用;用1.0 mmol/L过氧化氢进行胁迫处理,重组菌DHN14存活率显著增高,说明脱水蛋白DHN14能够提高大肠杆菌对过氧化氢胁迫的耐受性;在低温和脱水胁迫下,DHN14脱水蛋白对乳酸脱氢酶的活性具有保护作用。【结论】小麦脱水蛋白DHN14能够响应非生物胁迫,提高对低温、干旱、金属离子、过氧化氢的耐受性。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

烟草高亲和钾转运蛋白基因NtHAK5克隆及表达模式分析

【目的】克隆烟草高亲和钾转运蛋白基因（NtHAK5）,并分析其在不同非生物胁迫下的表达模式,为深入探究该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】从普通烟草K326中扩增NtHAK5基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pBWA (V) HS-NtHAK5-GLosgfp融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NtHAK5基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性,以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K+）的植株为对照（CK）。【结果】烟草NtHAK5基因CDS序列全长2418 bp,共编码805个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量为89874.00 Da,理论等电点（pI）为8.65,属于稳定性疏水蛋白,含有HAK家族蛋白典型的跨膜结构域。NtHAK5基因的二级结构中α-螺旋占40.12%,延伸链占24.97%,无规则卷曲占26.21%,β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%,与拟南芥AtHAK5相似性最高,为58.26%。NtHAK5基因启动子含有厌氧、低温、干旱、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应的相关顺式作用元件。NtHAK5蛋白定位在细胞膜上。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下,NtHAK5基因在根、茎、老叶和新叶中均有表达,且均以老叶中相对表达量最高。NtHAK5基因在干旱胁迫、冷害处理、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK （P<0.05）,但在低氮和低磷条件下的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05）。【结论】 NtHAK5基因属于HAK基因家族成员,具有明显组织表达特异性,参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应,推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K+转运体参与非生物胁迫下K+的吸收、转运和再利用。     

条锈菌诱导的小麦TaHin1的克隆与表达特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著,在小麦与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源植物激素水杨酸、茉莉酸诱导TaHin1上调表达,脱落酸诱导其下调表达,而乙烯不诱导其表达;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调表达。【结论】首次克隆到一个受条锈菌诱导的小麦TaHin1,可能通过水杨酸、茉莉酸信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,而脱落酸在防御反应中起负调控作用,该基因在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。     

甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆甘蓝bHLH转录因子（BobHLH121）基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件进行预测分析,并构建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS长度为1367bp,定位于C06染色体上,其编码311个氨基酸,蛋白分子量为34.89 kD,理论等电点（pI）为5.42,不稳定系数为52.29,疏水性平均系数为-0.733,说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白,且呈酸性,定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋（占30.87%）、延伸链（占9.32%）、β-转角（占2.89%）和无规则卷曲（占56.91%）组成,具有保守的HLH结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥（NP_191768.2）、琴叶拟 南 芥（EFH52923.1）、亚 麻 荠（XP_01909381.1）、荠 菜（XP_023638997.1）、油 菜（CDY65446.1）、白 菜（XP_009104362.1）和萝卜（XP_018442860.1）等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示,BobHLH121与拟南芥（NP_191768.2）和琴叶拟南芥（EFH52923.1）bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05,下同）,在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0h（对照）显著降低,在低温处理24h时急剧升高,显著高于其他处理时间,低温处理48 h时又显著降低,表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守结构域序列,具有明显的组织表达特异性,可能参与甘蓝叶片的生长发育调控,且响应低温胁迫,可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。     

渗透胁迫下烟草根系基因的表达谱分析

 【目的】了解干旱胁迫下烟草的抗旱机制。【方法】采用拟南芥基因芯片检测PEG渗透胁迫（-1.2 MPa）48 h后烟草根系中基因表达的变化。【结果】在31 182个基因微矩阵点中,有效差异表达（ratio 值≥2或≤0.5）的基因有126个,其中上调79个,下调47个。上调基因主要是根系中一些受渗透胁迫诱导参与信号转导的激素（主要是ABA）响应蛋白基因、钙信号响应蛋白基因及蛋白激酶基因。而下调表达的基因则主要是一些与烟株生长发育相关的赤霉素响应蛋白类基因和根系中参与蛋白质降解的泛素连接酶类基因。【结论】通过分析这些特异表达基因,揭示出烟草植株体在非生物环境胁迫条件下的一些响应机制,为阐明烟草抗旱的分子生物学机理提供了有价值的信息。     

湖北海棠病程相关蛋白MhPR8基因的克隆与表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆植物第Ⅲ类几丁质酶基因PR8的cDNA序列和基因组DNA序列,研究化学试剂SA、MeJA、ACC、ABA,非生物胁迫NaCl和低温（4℃）,生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导下MhPR8基因的表达特性。【方法】利用PCR技术分别从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库和基因组DNA中克隆MhPR8基因全长序列;利用生物信息学方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因的表达特性。【结果】该基因编码区为897 bp,编码298个氨基酸,蛋白质分子量为31.67 kD,等电点为4.77,命名为MhPR8。该基因在其编码区内部没有内含子。MhPR8蛋白含有保守的结构域GH18_hevamine_XipI_class_III,属于第III类几丁质酶。该蛋白含有6个保守的半胱氨基酸残基,含有植物第III类几丁质酶起催化作用的天冬氨酸和谷氨酸,分别位于第151和153位氨基酸。qRT-PCR分析结果表明,该基因在湖北海棠根中的表达量最大;SA、MeJA和ACC明显诱导该基因的表达,ABA略微诱导该基因的表达;低温诱导该基因的表达,而NaCl诱导该基因的表达不明显;生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导该基因的表达。【结论】湖北海棠MhPR8可能参与SA、JA/ET介导的信号通路中,在湖北海棠抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着非常重要的作用。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

矮牵牛冷响应锌指蛋白基因PhTZF1的分离与表达分析

利用矮牵牛基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的关键基因,从中发现1个CCCH型的锌指蛋白基因PhTZF1。通过RT-PCR分离获得该基因的cDNA全长为2 085bp,预测其编码694个氨基酸,含有2个CCCH型锌指蛋白保守结构域。系统进化树分析发现,PhTZF1与拟南芥AtSZF1相似度最高。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性发现,正常生长条件下该基因在各组织中的表达都较弱;利用实时定量PCR检测其在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下的表达情况发现,PhTZF1表现出不同程度的上调,其中对低温胁迫最为敏感且上调倍数最高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温、干旱等非生物逆境相关。