两个小麦LEA基因的特征及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦LEA基因TaLEA4和TaLEA5及其编码蛋白的特征,比较它们在干旱、高盐、热和冷胁迫过程中的表达模式,探讨这两个LEA基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为其在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术克隆小麦的LEA基因,通过生物信息学方法分析克隆基因及其编码蛋白的结构特性,采用qRT-PCR技术检测克隆基因对ABA及非生物胁迫的响应模式。【结果】克隆了2个包含完整编码框的小麦LEA基因TaLEA4和TaLEA5,分别编码180和163个氨基酸,推断其分子量分别为18.8和16.9 kD,理论等电点分别为5.6和7.2。基因组序列分析发现,2个LEA基因中均包含1个100 bp的内含子。氨基酸序列分析发现,这两个LEA基因编码蛋白均富含极性氨基酸（约占整个氨基酸序列的71%）,具有较强的亲水性。结构域分析显示,TaLEA4和TaLEA5蛋白中均包含1个典型的LEA_4（pfam:02987）保守域,属于LEA_4类蛋白。蛋白质高级结构分析显示,α-螺旋分别占TaLEA4和TaLEA5蛋白的96.7%和96.3%,并可形成弓形的空间结构;在TaLEA4中,检测到1个配体PEV（C₃₉H₇₈NO₈P）的结合位点,而在TaLEA5中存在2个这样的配体结合位点。表达特性分析显示,2个LEA基因均可被植物激素ABA诱导而上调表达,其中,TaLEA4的表达水平显著高于TaLEA5;TaLEA4在干旱、高盐和高温胁迫过程中均受胁迫诱导而迅速上调表达,但TaLEA5却只受干旱胁迫的诱导,且其表达水平显著低于TaLEA4;2个LEA基因对冷胁迫均无响应;干旱和高盐胁迫过程中,TaLEA4在根系中的诱导表达水平显著高于叶片,而热胁迫过程中该基因在叶片中的表达水平要显著高于根系,这可能与根系直接感受渗透胁迫而叶片直接感受热胁迫有关。【结论】小麦TaLEA4和TaLEA5均属于LEA基因家族的LEA_4亚类,具有较强的亲水性,它们属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络;TaLEA4可能在干旱、高盐和热胁迫过程中均发挥重要功能,TaLEA5仅参与小麦对干旱胁迫的响应,其作用要弱于TaLEA4。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

一个逆境诱导表达的水稻锌指蛋白基因的分离和鉴定

为鉴定逆境应答相关转录因子,以1个水稻EST为基础,通过RT-PCR分离到了1个编码锌指蛋白的转录因子新基因的全长cDNA,命名为OsZF19。该基因编码171个氨基酸,包含zf-AN1和zf-A20两个锌指结构域,预测的该基因启动子区含有逆境应答顺式元件。Northern杂交分析表明,OsZF19的确受到高盐和植物激素ABA胁迫的诱导,而在干旱胁迫早期显著地诱导表达,胁迫后期OsZF19的表达量轻微下降。试验结果表明,OsZF19可能在水稻对干旱和高盐逆境的应答反应中发挥作用。     

苹果抗性相关的谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1的生物信息学和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus domestica Borkh.）中抗苹果轮纹病相关的编码谷胱甘肽转移酶基因MdGSTU1,研究其在不同组织器官及不同逆境处理条件下的表达特性,为解析该基因的抗逆功能奠定基础。【方法】基于抗轮纹病相关的EST序列,通过在NCBI进行比对,得到一个谷胱甘肽转移酶（GST）基因相关的EST片段;然后在苹果基因组数据库中进行比对,获得该GST的编码框序列（coding sequence,CDS）,同时,设计RACE引物,克隆该基因的UTR序列;利用MEGA5.0软件对该GST蛋白与拟南芥GST家族蛋白成员进行系统进化树分析,使用DNAMAN软件对该蛋白的分子量、等电点等进行预测,并对其氨基酸序列进行分析;采用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的表达以及该基因在盐、模拟干旱和苹果斑点落叶病原菌处理条件下的表达特性;克隆该基因的启动子,利用PlantCARE软件在线分析该基因启动子上的顺式作用元件。【结果】进化树分析显示该GST与拟南芥中GST家族的U亚家族成员亲缘关系最近,故被命名为MdGSTU1;MdGSTU1的CDS为666 bp,编码221个氨基酸残基,其蛋白分子量为25.41 kDa,等电点为5.28;RACE结果显示该基因3'UTR区域为135 bp;蛋白序列及结构分析显示,其与拟南芥GST家族蛋白相同,该蛋白也包含保守的谷胱甘肽-S-转移酶的N端及C端结构域;PCR结果显示,MdGSTU1在根、茎、叶、花、果各组织中均有表达,但根中的表达水平最高,同时,该基因能够被150 mmol·L^-1 NaCl和20%的PEG诱导表达,均在1 h时表达量达到最高值;另外,苹果斑点落叶病原菌也能诱导MdGSTU1的表达,表达量在病菌处理8 h时达到最大;启动子分析显示MdGSTU1启动子区域含有多个抗性相关的作用元件,其中包括ABA响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、SA响应元件、JA响应元件以及防御和逆境响应元件;此外,该启动子上还包含多个MYB转录因子结合位点。【结论】MdGSTU1属于植物tau亚家族（GSTU）成员,生物及非生物逆境胁迫均可诱导该基因的表达。     

玉米锌指蛋白基因ZmAN14过表达转基因烟草对非生物胁迫的响应

【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21（H21）及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA诱导的表达谱进行分析,并结合启动子区顺式作用元件分布情况进行对比分析。将ZmAN14编码序列克隆至GFP表达载体pMDC85,利用亚细胞定位技术验证ZmAN14在胞内的定位情况。将ZmAN14克隆至GAL4 DNA结合结构域载体,并转化酵母,将其涂布在缺陷培养基上观察酵母生长情况,分析其有无转录激活活性。将ZmAN14编码区与植物表达载体p1300-221连接构建超表达载体,并将其转入烟草,选择ZmAN14 mRNA 表达量高的T₂纯合体株系进行盐、干旱胁迫和ABA诱导,观察其对非生物胁迫的应答。【结果】序列分析表明,ZmAN14开放阅读框（ORF）为516 bp,编码一个171个氨基酸的蛋白,预测分子量为18.3 kD,等电点是8.28。ZmAN14具有A20和AN1结构域,属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。实时定量荧光PCR结果表明ZmAN14在叶中大量表达,受NaCl、干旱胁迫和ABA诱导上调。ZmAN14与GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞核中,定位结果与ZNF216 和ZmAN13类似,而ZmAN14本身并没有核定位信号,暗示ZmAN14与其他蛋白结合进入细胞核中发挥其生物学功能。ZmAN14在酵母中表达时不能在酵母缺陷培养基（SD/-Leu-His medium）上生长,因此,未发现其具有转录激活活性。将ZmAN14在烟草中过表达会增加烟草苗期对盐和干旱的抗性。【结论】ZmAN14属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。ZmAN14主要在叶中表达,受非生物胁迫和ABA诱导,在烟草中过表达可以提高烟草苗期对盐和干旱的抗性。ZmAN14可能通过与其他蛋白的互作行使功能。相比较于其他的A20/AN1型锌指蛋白,在转基因烟草中,ZmAN14也参与非生物胁迫应答。ZmAN14与ZmAN13具有高同源性,但在盐和干旱胁迫时,二者却具有向反方向调控的功能。     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

普通小麦转录因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

【目的】非生物逆境是制约小麦生产的主要因素。WRKY转录因子是植物特有的转录因子家族,参与对多种非生物逆境胁迫的应答。普通小麦基因组中至少含有200个WRKY,目前仅对少数成员的功能进行了鉴定。通过克隆小麦WRKY转录因子TaWRKY35并揭示其功能,为改良小麦的抗逆性提供基因资源。【方法】利用小麦全长cDNA数据信息,从强抗旱小麦品种旱选10号中克隆逆境胁迫应答转录因子基因TaWRKY35;采用实时定量PCR技术,分析目标基因在不同发育时期、不同组织器官中的表达水平,以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低温等逆境胁迫下的表达模式;构建目标基因与GFP融合的表达载体,转化小麦原生质体,以确定目标蛋白在细胞中的作用位置;构建TaWRKY35过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,揭示目标基因的功能。【结果】TaWRKY35的开放阅读框全长1 134 bp,编码377个氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一个典型的WRKY结构域,C端有一个C₂HC型的锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅲ亚家族。测序发现TaWRKY35编码区序列非常保守,在32份多态性较高的六倍体小麦材料中未检测到DNA多态性。TaWRKY35在小麦的不同发育时期、不同组织中均有表达,其中在幼苗根基部表达量最高,约为苗期叶片中表达量的26倍;其次为幼芽根基,约为苗期叶片中表达量的21倍;接下来依次为孕穗期茎节、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期叶片,而在幼苗叶片中表达水平最低;同时在ABA、NaCl、PEG和低温胁迫条件下,小麦幼苗TaWRKY35的表达量均显著上升,表明TaWRKY35参与对4种逆境胁迫的应答,但在不同胁迫条件下表达模式差异显著,其中对盐胁迫最敏感。亚细胞定位发现,TaWRKY35特异定位在细胞核上,是典型的核定位蛋白。在高盐胁迫条件下,TaWRKY35过表达转基因拟南芥子叶白化率显著低于对照,TaWRKY35过表达转基因拟南芥的细胞膜稳定性和幼苗存活率均显著高于野生型对照,表明TaWRKY35能增强植物的耐盐性。【结论】TaWRKY35编码蛋白含有WRKY和C₂HC结构域,为WRKY家族第Ⅲ亚家族成员。TaWRKY35在小麦发育的不同时期、不同组织中均有表达,且受ABA、PEG、NaCl及低温等逆境胁迫诱导。过表达TaWRKY35能显著提高转基因拟南芥的耐盐性。     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

谷子转录因子基因SibZIP42在拟南芥中对高盐和ABA的响应

【目的】分析谷子抗逆相关转录因子基因Sib ZIP42的特性和生物学功能,探讨Sib ZIP42提高植物耐盐性的调控途径,为作物抗逆分子育种提供新的候选基因。【方法】利用生物信息学方法分析谷子Sib ZIP42的特性:使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子Sib ZIP42蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;从数据库Phytozome获取谷子Sib ZIP42上游2 000 bp作为启动子序列,在PLACE数据库对Sib ZIP42启动子顺式作用元件进行分析;使用Net Phos 2.0 Server数据库预测Sib ZIP42蛋白磷酸化位点;利用实时荧光定量PCR检测Sib ZIP42在不同胁迫条件下的表达模式;将Sib ZIP42与绿色荧光蛋白GFP融合表达,检测Sib ZIP42蛋白的亚细胞定位情况;构建植物表达载体p BI121-Sib ZIP42,转化拟南芥并检测转Sib ZIP42拟南芥的耐盐性及对ABA处理的敏感性。分析转Sib ZIP42拟南芥中ABA及脱水响应相关基因表达变化,分析Sib ZIP42调控植物耐盐性的作用机制。【结果】谷子Sib ZIP42全长546 bp,编码由181个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为20.3k D,基因编码区包含1个外显子;系统进化树分析表明该基因位于b ZIP基因家族的S亚组;Sib ZIP42与拟南芥Atb ZIP42序列同源性最高;启动子元件分析表明,Sib ZIP42包含ABRE、MYB、MYC等多种逆境胁迫应答相关元件;磷酸化位点分析结果显示Sib ZIP42含有14个丝氨酸、4个酪氨酸和1个苏氨酸磷酸化位点;实时荧光定量PCR结果显示,Sib ZIP42对多种非生物胁迫均有不同程度的响应,在高盐、干旱(PEG)和ABA处理条件下表达量明显上升,Sib ZIP42在根部的表达量显著高于在茎及叶子中的表达;亚细胞定位结果表明,Sib ZIP42蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在正常MS培养基上,野生型拟南芥WT和Sib ZIP42转基因拟南芥的萌发率基本一致,在Na Cl浓度为90、120和150 mmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥萌发率显著高于WT,在90 mmol·L~(-1) Na Cl处理条件下,转基因拟南芥的绿化率显著高于WT;在ABA浓度为0.5、1和2μmol·L~(-1)的MS培养基上,转基因拟南芥的绿化率显著低于WT;下游基因检测结果表明,HIS1-3、RD29B和RAB18等ABA胁迫响应相关基因以及脱水响应相关基因At PIP2A在转基因植株中表达量显著高于在WT中的表达,表明Sib ZIP42可能通过ABA信号途径提高植物对高盐胁迫的耐性。【结论】与WT相比,Sib ZIP42转基因拟南芥株系在种子萌发时期耐盐性显著提高。同时,在种子萌发后期Sib ZIP42转基因株系相比于WT对ABA处理的敏感性增强,Sib ZIP42可能通过ABA信号途径正向调控植物的耐盐性。     

甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。     

紫花苜蓿NAC类转录因子基因MsNAC2的克隆及其功能分析

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因MsNAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解MsNAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿MsNAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建MsNAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建pBI121-MsNAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达MsNAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】MsNAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 kD,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙CsNAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明MsNAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsNAC2受250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000、0.1 mmol·L^-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且MsNAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在NaCl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L^-1 NaCl、20% PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因MsNAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达MsNAC₂烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

小麦脱水素基因TaDHN-1的特征及其对非生物胁迫响应

【目的】分析小麦脱水素基因特征及其在干旱、高盐、低温和高温胁迫过程中的表达模式,探讨脱水素在小麦抗逆过程中的功能,为脱水素基因在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR克隆小麦脱水素基因,通过生物信息学分析研究其编码蛋白特征;采用qRT-PCR分析该基因表达特性模式。【结果】克隆了包含完整编码区的小麦脱水素基因TaDHN-1,序列分析显示该基因cDNA长487 bp,编码112个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为11.5 kD,等电点为6.6。氨基酸序列分析表明,TaDHN-1在C端具有保守的K片段,属于Kn类脱水素;二级结构预测显示,该脱水素无规则卷曲占整个蛋白的82.1%,具有很高的亲水性;PredictProtein预测显示,该脱水素无跨膜区域,亚细胞定位于细胞质中。表达特性分析表明,TaDHN-1受植物激素ABA的诱导;在干旱、高盐和低温胁迫条件下,该基因均受胁迫的诱导而表达上调,但对42℃高温胁迫不敏感;在种子发育过程中,TaDHN-1的表达呈下调趋势,且在种子发育后期的表达量极低,推测TaDHN-1不参与小麦种子成熟后期的脱水保护过程。【结论】小麦脱水素基因TaDHN-1属于脱水素基因家族的Kn亚类。该基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应路径发挥功能,可能参与了小麦对干旱、高盐和低温胁迫的耐受调节过程,但对高温胁迫不敏感,也未参与种子发育后期的脱水保护过程。