利用花粉管通道技术创造棉花变异种质及其SSR标记分析

将海岛棉品种海7124的基因组总DNA通过花粉管通道导入到陆地棉品种石远321中,获得了纤维品质明显改善的优良新种质系,而且在后代材料中还获得了一个形态性状发生明显变异的突变体。利用SSR标记对DNA供体、受体及突变体二代材料进行了多态性分析,结果表明,海岛棉DNA片段已经整合到受体基因组中,这为花粉管通道技术提供了间接的分子生物学证据,同时对外源DNA片段的整合机制进行了探讨。     

普通小麦DNA导入裸大麦变异观察及SSR分子验证

利用花粉管介导法将普通小麦(宁春4号)的总DNA片段导入裸大麦(康青3号)中获得18个变异品系,通过对农艺性状的观察,在裸大麦中发现了普通小麦的部分农艺性状;经过对受体、供体和变异后代的SSR鉴定分析,18对SSR-PCR中16个位点发现了普通小麦信号,从DNA分子水平证明了普通小麦DNA片段可以通过花粉管通道介导法导入裸大麦品种康青3号中,并能够整合到其基因组中.     

野生稻DNA片段存在于高世代水稻变异系进一步的分子验证

【目的】小粒野生稻(O. minuta) DNA导入水稻保持系V20B，第1代（D1）获得变异株,经过连续16代繁育，选出了完全稳定遗传的新不育系及其保持系“野威A”/“野威B”。本试验旨在从分子水平上证明野生稻DNA转移整合进栽培稻“野威B”基因组中，并能稳定遗传。【方法】通过RAPD分析、RAPD扩增特异条带测序分析及AFLP分析等方法揭示了远缘资源基因组DNA导入栽培稻的高世代变异系的基因组整合了远缘基因组片段。【结果】对供体（小粒野生稻）、变异系（野威B）和受体（V20B）进行RAPD分析发现，变异系含有供体存在而受体不存在的“特异带”，在此基础上，对“特异带”，DNA片段进行了核苷酸序列分析, 发现RAPD引物OPG-11在变异系与供体中扩增出的1对“特异带”DNA片段的长度均为975 bp, 二者间存在97%的同源性，有29个碱基的差异，碱基突变包括转换、颠换、插入及缺失4种类型；同时，AFLP分析表明：高世代（第16代）变异系“野威B”与受体（V20B）存在大量遗传多态性，并含有供体特异AFLP标记。【结论】证明了野生稻DNA向栽培稻的转移整合。     

外源大豆总DNA导入木豆品种的研究

用大豆总DNA通过花粉管导入木豆品种ICPL87091和ICP7035中，在D3代出现茎色，花色，叶色，叶型等变异的植株，从中选择农艺性状优良的12个单株进行全基因组原位杂交分析。用大豆桂品24-2号的DNA经地高辛标记后作为探针，对大豆桂品24-2号（供体），木豆ICPL87091（受体）和ICP7035（受体）以及用大豆总DNA通过花粉管通道转导的木豆转化株的基因组DNA，进行分子杂交探查，大豆探针可以探查出一些木豆转化株内有很强的杂交信号，比较受体，供体和转化株的原位杂交图谱，发现有7个木豆转化株的DNA与供体大豆DNA有很高的同源性片段，有5个转化株的木豆DNA与供体大豆DNA有杂交信息但信号弱，表明来自供体大豆总DNA的部分序列已整合到木豆基因组里并在其后代的性状里得到表达。     

导入燕麦DNA的小麦变异后代叶绿素含量变化的研究

利用花粉管通道途径将燕麦Avena sativa L.总DNA导入宁春4号小麦中，对供体、受体及D5代的变异株系进行叶绿素含量测定，发现部分变异后代的叶绿素含量发生了变化，表现类似于供体。表明燕麦的DNA片段已通过花粉管通道进入小麦，并引起生理性状的变异。     

棉花产量构成因素性状的全基因组关联分析

【目的】 对铃重、衣分、单株铃数和籽指等棉花产量构成因素性状进行全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）,发掘与其关联的标记位点、优异等位变异及候选基因,为棉花产量的分子育种提供理论依据。【方法】 以408份陆地棉品种（系）资源为材料,利用Cotton SNP 80K芯片,对6个环境的铃重、衣分、单株铃数和籽指4个产量构成因素性状进行基于混合线性模型（mixed linear model,MLM）的全基因组关联分析,检测与产量构成因素性状显著关联的位点、优异等位变异;进一步依据转录组数据的基因表达量,在显著关联的位点侧翼序列1 Mb区间挖掘可能的候选基因。【结果】 4个产量构成因素性状在不同环境下均表现出广泛的表型变异,其中,单株铃数变异系数最大为16.67%—22.66%,各性状的遗传率为48.4%—92.2%;除铃重与衣分间相关性不显著外,其他性状间均呈显著或极显著相关性;基于6个环境各性状表型数据的最佳线性无偏预测值（best linear unbiased prediction,BLUP）,GWAS共检测到分布于基因组的7个区间内23个与目标性状关联的SNP位点,其中,与铃重关联的位点5个,与衣分关联的位点1个,与单株铃数关联的位点9个,与籽指关联的位点8个,有3个位点（TM21094、TM21102和TM57382）同时与多个目标性状关联;鉴定到7个最优SNP位点的优异等位变异,分别为TM21099（TT）、TM57382（GG）、TM78920（CC）、TM53448（TT）、TM59015（AA）、TM43412（GG）和TM69770（AA）;利用转录组数据分析,在基因组的7个区间筛选到158个与产量形成可能的候选基因,GO富集分析和KEGG代谢途径分析发现,候选基因功能类别多样并参与了多种代谢途径。【结论】 在陆地棉品种（系）群体中共鉴定到23个与产量构成因素性状关联的SNP位点,筛选到158个可能与产量性状相关的候选基因。     

棉花T—DNA标签雄性不育突变体的遗传分析

利用农杆菌介导T—DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉（Gossypium hirsutum L）Coker 312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1：1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T—DNA插入共分离,从而认为突变是由T—DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T—DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。     

野生稻DNA导入水稻后代的抗病性遗传规律研究

通过花粉管通道法将野生稻DNA导入水稻,已从受体宁粳16号、宁粳23号的转化后代中选育出可稳定遗传的变异株系。主要特征为:(1)品质较对照表现突出,产量高,综合性状好;(2)在D1、D2、D3代进行跟踪接种鉴定抗病性,筛选到稳定遗传的抗病变异株系。由此可见,野生稻DNA导入水稻后会发生广泛变异,外源DNA片段通过重组,可整合到受体基因组。     

外源DNA导入玉米引起后代性状变异的研究

采用浸胚法将大豆DNA导入玉米自交系,获得变异植株D0代及D1代植株。考察D0代变异株及D1代植株的性状,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对D0代植株及其供体进行了过氧化物同工酶分析,从而初步证实了大豆DNA的功能片段已整合到了受体基因组内并得到了表达。     

陆地棉空间诱变SP1～SP3主要性状变异分析

为了解陆地棉空间诱变第1代至第3代(SP_1～SP_3)的性状变异情况,2007—2009年对搭载"实践八号"卫星的2份陆地棉材料进行连续多代性状考察,将诱变后代群体主要性状的平均值、变异系数与对照群体进行比较。结果表明,诱变后代SP_1～SP_3衣分、铃质量性状的变异有逐代下降的趋势,而纤维品质性状的变异在SP_3达到最大。SP_3是突变体集中产生的主要时期,2个SP_3群体中均出现了较多优质棉突变个体,其品质指标较原始品种有了显著提升,表明空间诱变可能对改良棉纤维品质有较大正向作用。     

棉花茎尖农杆菌转化体系的建立

[目的]建立高效的以草甘膦为选择剂的棉花茎尖农杆菌遗传转化体系。[方法]以中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312号4个陆地棉品种茎尖为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导转化法,结合草甘膦筛选,探讨了影响棉花茎尖遗传转化效率的几个重要因素。[结果]棉花茎尖对草甘膦极为敏感,所有品种棉花茎尖均在60μmol／L草甘膦浓度下停止生长。对茎尖用OD600=1．0菌液浸染20min、预培养2d、恢复培养1周和共培养72h的处理能显著提高棉花遗传转化效率。对所有成活转基因棉株进行PCR检测的结果表明,所有植株均能扩增出目的基因aroA—M1 1．3kh的特定条带。[结论]该研究为进一步加速转基因棉花的产业化进程奠定基础。     

转双价基因(Bt+CpTI)抗虫棉对棉蚜羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力的影响

[目的]研究了转双价基因棉SGK321对棉蚜Aphis gossypii Glover羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力的影响,为转基因棉的生物安全性评价提供理论依据。[方法]在SGK321及其亲本棉石远321上长期饲养棉蚜,研究2种棉花品种对棉蚜短期（第1、2、3代）和长期（第41、42、43代）的影响。[结果]在SGK321上取食1代的棉蚜种群羧酸酯酶比活力显著高于在亲本棉上取食1、2、3代的棉蚜种群,转双价基因棉SGK321上饲养1、2、3代的棉蚜乙酰胆碱酯酶比活力均显著高于在石远321上饲养相同代数的棉蚜。但长期饲养的2种棉蚜之间羧酸酯酶比活力、乙酰胆碱酯酶比活力无显著差异。[结论]长期取食转双价基因棉SGK321的棉蚜通过棉蚜解毒酶的调节作用对SGK321产生了适应性。     

子房注射法获得转基因抗虫棉植株研究

采用子房注射法将构建在植物表达载体ｐＢＩ１２１．１上的Ｂｔ杀虫基因导入棉花品种石远３２１、中植３７２、８２２和辽棉９００１中,获得８株转基因植株。经温室抗虫性鉴定,８株转基因植株对棉铃虫都表现出较好的抗性。同时对这８棵株叶片进行的ＰＣＲ检测结果证明Ｂｔ基因已经整合进植物基因组中。     

转双价基因(Bt+CpTI)抗虫棉对棉蚜羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力的影响(英文)

[目的]研究了转双价基因棉SGK321对棉蚜Aphis gossypii Glover羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力的影响,为转基因棉的生物安全性评价提供理论依据。[方法]在SGK321及其亲本棉石远321上长期饲养棉蚜,研究2种棉花品种对棉蚜短期(第1、2、3代)和长期(第41、42、43代)的影响。[结果]在SGK321上取食1代的棉蚜种群羧酸酯酶比活力显著高于在亲本棉上取食1、2、3代的棉蚜种群,转双价基因棉SGK321上饲养1、2、3代的棉蚜乙酰胆碱酯酶比活力均显著高于在石远321上饲养相同代数的棉蚜。但长期饲养的2种棉蚜之间羧酸酯酶比活力、乙酰胆碱酯酶比活力无显著差异。[结论]长期取食转双价基因棉SGK321的棉蚜通过棉蚜解毒酶的调节作用对SGK321产生了适应性。     

双价抗虫转基因棉花研究

构建了携带人工合成的GFM CryIA杀虫基因和经过修饰的CpTI基因的高效双价杀虫基因植物表达载体pGBI121S4ABC。采用花粉管通道法,将pGBI121S4ABC转入到石远321、中棉所19号、3517和541中国棉花生产品种中,首次获得了双价转基因抗虫棉株系。叶片室内抗虫生物学鉴定表明,抗性好的株系棉铃虫幼虫校正死亡率大于96%;经分子检测,证实了双价杀虫基因在棉花基因组中的整合与表达。     

新疆特定生态条件下陆地棉数量性状遗传参数的研究

本研究以新疆各主要棉花育种单位近几年来选育出的性质，丰产陆地棉新品种（系）为材料，估算了在新疆特定生态条件和栽培模式下陆地棉数量性状的遗传参数，为新疆棉区陆地棉新品种选育提供科学可靠的理论依据，遗传力的分析表明单铃重和纤维品质等性状可以在早代选择，而大多数性状最好在高代采用连续混合选择。新疆自育品种的遗传变异度都不大，说明新疆的遗传资源利用有限，应注意扩大亲本的遗传变异范围。聚类分析将所用材料分成六类，具体结果说明新疆主要育种单位在育种目标，育种技术和亲本选配上有相似之处，在新疆的育种工作中遗传基础贫乏的矛盾日益突出，已严重影响了育种效率。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

土耳其斯坦叶螨对转基因棉花的寄主选择性

为了研究土耳其斯坦叶螨对转基因棉及其亲本常规棉寄主选择性,以及转基因植物生化特性及形态特征对叶螨寄主选择性的影响,以转基因棉花中棉41、SGK321及其亲本常规棉中棉23、石远321为材料,通过半叶碟选择性试验研究棉叶螨对棉花的取食选择性及产卵选择性,并测定不同品种棉花的营养物质和次生代谢物的质量分数及形态指标。结果表明,棉叶螨对常规棉中棉23和石远321表现出明显的取食偏好和产卵偏好性;转基因棉花中次生代谢物棉酚的质量分数显著高于亲本棉花。因此,土耳其斯坦叶螨对常规亲本棉花的寄主偏好性可能与外源基因导入引起植株代谢变化有一定关系。     

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。