转化CMV—cp基因番茄对CMV病毒抗性鉴定

苗期人工接种，对转化ＣＭＶ－ｃｐ基因的番茄品种８８０５Ｒ１－Ｒ４代进行接种ＣＭＶ病毒试验。结果表明：黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因在番茄中的表达，对抑制ＣＭＶ病毒症状的表现及延迟其发展均起到一定作用。８８０５Ｒ３代对ＣＭＶ的抗性明显高于Ｒ１代，Ｒ４代抗性已基本稳定。当高浓度的ＣＭＶ病毒侵染Ｒ４代植株时，也会出现１００％的发病率，但它们的新生枝叶能正常生长并开花结果。利用半叶法测定８８０５Ｒ４（ｃｐ＋）及     

转CMV—CP基因番茄后代的田间抗病性

以土壤农杆菌为介导，用叶盘法转化获得的转ＣＭＶ－ＣＰ基因（黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因）番茄工程植株，通过连续选择和自交，得到Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４和Ｒ５代的转化番茄植株。１９９３－１９９４年采用人工接种和田间自然发病两种方式鉴定转化植株对ＣＭＶ病毒的田间抗性。结果表明，转基因番茄植株对ＣＭＶ侵染有高度抗性。人工接种Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４代转化植株的防病效果达５０－７３％。有５０％以上的转基因植株始终     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

转TCS基因番茄及其后代性状稳定性的比较与分布

转ＴＣＳ基因番茄无性系ＴＰ３与其自交后代Ｒ１的种子苗在农艺性状上的表现无差异，Ｒ１代植株Ｘ－ｇｌｕ检测和ＰＣＲ扩增均呈阳性，同样对ＴＭＶ和ＣＭＶ表现出一定的抗病性，这说明转基因番茄无性系及其自交一代种子苗植株的ＴＣＳ基因是稳定表达的稳定遗传的，因此，除了经过种子获得种苗以外，通过无性繁殖转基因番茄可以直接进行田间种植及种苗的工厂化生产。     

双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析

通过对转ＴＭＶ和ＣＭＶ双价外壳蛋白基因番茄Ｔ１代群体和Ｔ２代株系进行ＰＣＲ及ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定，并分别进行温室及田间抗病毒试验，结果表明，Ｔ１代工程番茄植株中确有ＣＭＶ—ＴＭＶ双价外壳蛋白基因的遗传和分离，其遗传行为符合显性单基因的孟德尔遗传。Ｔ２代部分株系ＣＭＶ—ＴＭＶ双价ＣＰ基因已获得稳定遗传，共获得了３个遗传稳定的番茄株系。     

双抗TMV CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

本研究在已构建ＴＭＶｃｐ和ＣＭＶｃｐ双价植物表达载体,建立辣椒高效遗传转化体系 的基础上,以农杆菌介导的转化法转化辣椒栽培品种：农大４０及湘研一号,对获得的５２株抗卡 那霉素再生植株进行点杂交鉴定及ＰＣＲ检测,点杂交获得１６株ＴＭＶ和ＣＭＶｃｐ基因同时表 现阳性的植株,ＰＣＲ检测发现有２株为假阳性。进一步温室攻毒试验表明,有７株转基因辣椒植 株对ＴＭＶ和ＣＭＶ同时表现免疫。     

CaMV基因Ⅵ在拟南芥上的遗传转化及交叉保护

通过对ＣａＭＶＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１株系基因Ⅵ的克隆和转化，在根癌农杆菌菌种ＧＶ３１０１的介导下，利用真空渗入法获得了转化ＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１基因Ⅵ的拟南芥转基因植株。分子检测表明，基因Ⅵ已整合进拟南芥基因组并有不同程度的表达。在转基因植株中，出现了类似病毒感染症状、多生长点及花粉生活力较低等个体的变异株。而多数转基因植株（占转基因植株７０．４％）为无症状的正常植株。对转化ＣａＭＶＢａｒｉ－１株系基因Ⅵ的９个无症状转基因株系接种ＣａＭＶＣＡＢＢ－ＢＪＩ病毒抗性表明，９个转基因株系表现出了不同的抗性     

转CMV—CP基因番茄植株的抗病表现

转ＣＭＶ－ＣＰ基因的番茄植株对ＣＭＶ侵染表现显著的抗性,温室中接种的植株无症率为Ｒ１代９４％,Ｒ２代９５．１％,Ｒ３代９５．４％,Ｒ４代９５％;大田中自然发病的植株无症率为：Ｒ２代６５．６％,Ｒ７６．９％。     

马铃薯Y病毒6kD和NIa基因转化的烟草介导抗病性

将马铃薯Ｙ病毒中国分离株（ＰＶＹ－Ｃ）的６ｋＤ和ＮＩａ基因拼接和改造，分别构建了其正向表述和反向转录的植物表达载体。借助土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４将在此双元载体上的６ｋＤ和ＮＩａ基因及新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）转入到烟草品种ＮＣ８９的染色体上，从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用ＰＶＹ－Ｃ对这些转化烟草进行抗性接种试验，结果表明部分转基因植株能够抵制ＰＶＹ－Ｃ的侵染，对抗病植株的子一代（Ｒ１）进行进一步的抗性分析发现，其Ｒ１代通过遗传也获得了这种抗病性。     

甘兰型油菜双低品种抗病毒遗传转化的研究

用携带植物抗病毒基因表达栽体ｐＢＴＵ的农杆菌转化油菜双低品种Ｈ０９０．Ｈ１６６，最大量转基因植株。栽体质粒ＰＢＴＵ上有卡那霉素抗性标记基因和ＣａＭ３５Ｓ启动子控制的芜菁花叶病毒ＴｕＭＶ－ｃｐ外壳蛋白基因，用品种Ｈ０９０和１６６的带柄子叶与携带载体质粒的农杆菌共培养后，将其转移到含有６－ＢＡ１－１０ｍｇ／ｌ的ＭＳ培养其中，７－１５天后又将其转移到含有６－ＢＡ１－１０ｍｇ／ｌ的ＭＳ加卡那霉素１０ｍｇ的     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

通过根癌农杆菌介导法获得新疆甜瓜抗病优质新品系

用新疆甜瓜无菌苗子叶块,通过根癌农杆菌介导法,将黄瓜花叶病毒外壳蛋白ｃＤＮＡ基因导入“新红心脆”等６个品种（系）,经卡那霉素筛选,获得大量Ｋｍ抗性植株,其中部分Ｋｍ抗性植株经Ｌｕｉｓ法检测,表达了胭脂碱合成酶活性。进一步经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ＤＯＴ－Ｅｌｉｓａ,ＰＣＲ特异扩增。Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法检测,结果证明了Ｋｍ抗性植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因,长度为１ｋｂ,并能有效表达,表达产     

反义ACC氧化酶基因的导入对番茄乙烯生成的抑制作用

将反向克隆的ＡＣＣ氧化酶基因通过Ｔｉ质粒导入到番茄基因组中，转基因番茄植株叶片和果实中ＡＣＣ氧化酶活性和乙烯产生速率均受到显著抑制，显示出反义基因能抑制靶基因（ＡＣＣ氧化酶）的表达。子代抗性标记基因的分离结果表明呈单基因遗传。     

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。     

谷胱甘肽还原酶基因的表达载体构建及对马铃薯的转化

 利用 ｐＧＲ２０２和 ｐＢｉｎ１９两种质粒经过 ｐＢＩ ２２２的改建，含有 ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 Ｎｏｓ终止子的 ＣＮ区ＤＮＡ片段与 ｐＢｉｎ１９的 Ｂｉｎ区 ＤＮＡ片段的不对称连接和目的基因 ＧＲ的 ｃＤＮＡ重组于真核表达双元载体三步亚克隆，筛选出一正向插入的谷胱甘肽还原酶基因的真核表达双元载体质粒ｐＢｉｎ－ＣＮ－ＧＲ。再利用此质粒转化的农杆菌ＬＢＡ４４０４进行马铃薯的遗传转化．并分化出卡那霉素抗性苗。过氧化物同工酶和酯酶同工酶谱带显示转化材料与对照之间存在显著的差异．表明转化材料的基因表达发生了变化。对转化影响因素的研究发现培养基的组成成分、选择压（Ｋｍ）添加浓度及加入时机是影响转化率的重要因素。     

CaMV基因Ⅵ在拟南芥上的遗传转化及交叉保护

通过对ＣａＭＶ ＣＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１株系基因Ⅵ的克隆和转化，在根癌农杆菌菌种ＧＶ３１０１的介导下，利用真空渗入法获得了转化ＧＡＢＢ－ＢＪＩ和Ｂａｒｉ－１基因Ⅵ的拟南芥转基因植株。分子检测表明，基因Ⅵ已整合进拟南芥基因组并有不同程度的表达。在转基因植株中，出现了类似病毒感染症状、多生长点及花粉生活力较低等个体的变异株。而多数传基因樾株（占转基因植株７０．４％）为无症状的正常植株。对转化Ｃａ     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF5基因的克隆及序列分析

本研究利用对应于ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ－２３３２株及ＬＶ株ＯＲＦ５基因保守序列的１对均为２５个碱基的引物１００５ＰＳ、１００６ＰＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增出了包括完整ＯＲＦ５基因的ＤＮＡ片段,片段长约７３０ｂｐ。将此片段定向克隆入ｐＵＣ１８载体的ＥｃｏＲＩ和ｓｔＩ位点之间,获得了Ｂ１３ＯＲＦ５基因与ｐＵＣ１８载体的重组质粒。通过ＥｃｏｒＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏｒＩ／ＨｉｎｄⅢ     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），扩增克隆传染性法低囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因，并ＶＰ２基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析，同时将ＶＰ２基因与真核表达载体ｐｃＮＤＡ３相连接。结果克隆到ＶＰ２基因全序列长１３５６ｂｐ，分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似，同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游，得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

《中国农业科学》2001年总目次

作物遗传育种·种质资源１（１）利用水稻ＢＡＣ克隆对Ｇｍ－２和Ｇｍ－６在药用野生稻中的ＦＩＳＨ定位 覃 等１（５）基因枪法获得ＧＮＡ转基因小麦植株的研究 徐琼芳等１（９）小麦品种糊化特性研究 阎 俊等１（１４）大豆对 ＳＭＶ３号株系的抗性遗传分析及抗病基因的 ＲＡＰＤ标记研究 郑翠明等１（１９）马铃薯离体块茎发育过程中的关键因子及其与蛋白质组分的关系 王大勇等２（１１７）谷物胚乳性状数量基因图的构建方法 徐辰武等２（１２３）稻米淀粉ＲＶＡ谱的基因型。环境互作效应分析 包劲松等２（１２８）小麦遗传转化几个因素…