甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的 …

以大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的ＲＮＡ为模板,采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,扩增出１１３４ｂｐ的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒ｐＵＣ１９Ｄ。以Ｋｐｎｌ从Ｘｂａｌ从ｐＵＣ１９Ｄ上切下此基因并插入质粒ｐＥｍｕ－ｍｃｓ－Ｎ得到植物表达载体ｐＰＰＩ８。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴１２７、陕１６０和晋麦４７,通过卡那酶     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

兔出血症病毒主要结构多肽的纯化及免疫保护性试验

人工感染ＲＨＤＶ－ＮＪ株病死兔肝经－５０℃反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、差速离心,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒,纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣｕＣｌ２负染色后,切取主要结构多肽ＶＰ１（６４．５ＫＤ）凝胶带,除去ＣｕＣｌ２和ＳＤＳ获得ＶＰ１,高效液相色谱鉴定只有一个蛋白峰,Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ,ＨＡ和ＨＩ结果显示纯化ＶＰ１具有良好的抗原表位稳定性。无母源抗体的３月龄兔１     

牛冠状病毒4H12/1D4单链基因片段在大肠杆菌中的表达

用ＥｃｏＲＩ酶切ＰＲ５Ｂ４质粒，采用“Ｖ”字形内槽电洗脱法回收约０．８０４Ｋｂ牛冠状病毒基因工程抗体４Ｈ１２／１Ｄ４单链基因片段，并将其插入载体质粒ＰＥＴ－１７ｂ的ＥｃｏＲＩ位点构成重组质粒ＰＥＴ－Ｄ４，将重组质粒转化ＤＨ５α感受态细胞，在ＩＰＴＧ的诱导下表达，细菌裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳筛选，发现含ＰＥＴ－Ｄ４细菌经诱导新增一条约２８ＫＤα蛋白带，该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符，经光密度扫描，表达量约占菌体总蛋白的１４％     

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄及其对CMV的抗性

利用根瘤土壤杆菌Ｔｉ粒转化系统，采用叶盘法将ＣＭＶ－ｃｐ基因转入番茄细胞中，获得４２株转基因植株，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测，证明ＣＭＶ－ｃｐ基因已进入番茄核染色体中，并能正常表达。通过对转基因植株Ｒ１和Ｒ２代苗期人工接种ＣＭＶ鉴定，发现ＣＭＶ－ｃｐ基因产物对ＣＭＶ有一定抗性，其抗性遗传符合孟德尔－对基因控制性状的遗传规律并能稳定遗传。     

牛生长激cDNA的表达与检测

利用低融点琼脂糖凝胶电泳，回收牛生长激素ｃＤＮＡ全序列，克隆于原核表达载体ＰＴ７７－７中Ｔ７启动子下游，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，经分离，酶切分析，获得６个牛生长有质粒ＰＴＧＨ１－６，选取其中两质粒ＰＴＧＨ１１－２，转化Ｅ．ｃｏｌｉＫ８３＝ｐＧ１－２，４２℃诱导３０ｍｉｎ，收集，破裂菌体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，于２２ＫＤ处有一特异性蛋白带，经ＳｈａｍａｄｚｕＣＳ９３０扫描测定，其表达量     

大鼠肝酷蛋白激酶Ⅱ的分离纯化和鉴定

依次采用ＤＥＡＥ－纤维素、肝素－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，酷蛋白－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和羟基磷灰石层析将大鼠酷蛋白激酶Ⅱ纯化了２４８６倍，回收率９．５％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明ＣＫⅡ由三个不同亚基组成，分子量分别是３７，３５和２６ＫＤ。该激酶利用酷蛋白为底物，Ｃａ＾２＋，Ｃａ＾２＋－磷脂酰丝氨酸的ｃＡＭＰ对ＣＫⅡ的活性无影响，而肝素对该酶的活性有抑制作用。     

小麦胆色素原脱氨酶的电泳性质分析

经反应红１２０亲和层析纯化的小麦胆色素原脱氨酶（Ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ,ＰＢＧＤ,ＥＣ．４,３,１,８）,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ－ＰＡＧＥ上均显示一条带,表明已ＰＢＧＤ纯化至均一,它的亚基分子量３６ＫＤ,ｐＩ为４．８。酶活性染色呈一条带,表明无同工酶存在。ＰＡＧＥ显示两条带,证明小麦幼苗中存在酶与底物结合的中间物。脲梯度电泳呈现之字形,在４ｍｏｌ／Ｌ的脲浓度下可使酶     

抗蔓枯病甜瓜突变体edr2抗病现象的初步研究

 【目的】蔓枯病常引起甜瓜毁灭性的损失,研究甜瓜与蔓枯病菌互作的功能基因对选育抗蔓枯病的甜瓜品种是非常重要的。【方法】采用农杆菌侵染子叶外植体的方法产生T-DNA插入的甜瓜突变体,人工气候箱内离体和大棚内幼苗接种蔓枯病菌,筛选蔓枯病抗性增强的突变体株系,并且初步研究该突变体的抗病机制。【结果】一个蔓枯病抗性明显增强的突变体,命名为edr2,该突变体是T-DNA单拷贝插入甜瓜染色体引起的,edr2的蔓枯病抗性和标记基因卡那霉素抗性基因共分离。蔓枯病菌在突变体甜瓜edr2上的侵染过程与在野生型甜瓜上相比,分生孢子萌发率降低、芽管的伸长和菌丝的生长较迟缓。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突变体发生细胞程序性死亡,但是不引起野生型甜瓜的细胞发生程序性死亡。【结论】edr2突变体抗性增强,不但抑制病菌在植株体内的生长,并且诱导自身的抗性。本研究为选育抗蔓枯病的甜瓜品种提供了新的思路,为挖掘甜瓜－蔓枯病菌互作的基因提供支持。     

苦瓜抗白粉病SCAR分子标记的开发

[目的]获得与苦瓜抗白粉病基因紧密连锁的分子标记,为加快苦瓜抗白粉病新品种的选育奠定基础.[方法]以高抗白粉病野生苦瓜MC18为父本、高感白粉病苦瓜栽培种MC1-2为母本创建F2代分离群体;经单株抗病性鉴定后,以BSA法构建F2代单株的高抗和高感白粉病苦瓜DNA近等基因池;利用SRAP技术筛选多态扩增片段,对仅在抗白粉病近等基因池和父本中出现的差异片段进行同收、测序、比对和转化成SCAR标记,并利用已知抗病性的单株DNA分析标记与苦瓜抗白粉病的相关性.[结果]从1188对SRAP引物组合中筛选到稳定阳性差异条带的引物组合5对,其中ME20EM5引物对扩增的差异条带长度为332bp,与葡萄抗体蛋白基因（抗性基因）的DNA序列有较高相似性,并将其成功转化成与苦瓜白粉病抗性相关、大小为320 bp的SCAR标记.[结论]开发的SCAR-ME20EM5分子标记可用于苦瓜抗白粉病分子标记辅助选择.     

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因在甜瓜不同品种中的表达

Na＋/H＋逆向运输蛋白基因在植物耐盐性方面起着极为重要的作用。根据同源基因保守序列设计引物,通过RACE方法从甜瓜中克隆了Na＋/H＋逆向转运蛋白基因,命名为CmNHX1（FJ843078）。序列分析表明,该基因全长2 534bp,开放读码框为1 659bp,编码553个氨基酸多肽。氨基酸同源性分析表明该蛋白与液泡型Na＋/H＋逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na＋/H＋逆向转运蛋白的亲缘关系较远。RT-PCR表达分析结果表明,CmNHX1在甜瓜根茎叶中均有表达,而且随着NaCl浓度和处理时间的增加,在根中表达持续增强,叶片中表达持续下降。耐盐品种‘金辉’根、茎和叶中的CmNHX1表达均高于盐敏感品种‘天仙’根、茎和叶中的表达。有趣的是在根中的表达,CmNHX1相对表达量在‘金辉’中是‘天仙’的2倍。CmNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性,说明CmNHX1具有转运Na＋的功能。研究结果表明CmNHX1是一个液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白,在甜瓜盐胁迫过程中起着重要作用。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化辣椒的研究

以辣椒品种'B162'为试材,探讨了通过根癌农杆菌介导法将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)基因转化辣椒的适宜条件.结果表明,将辣椒带柄子叶进行预培养2 d后,用D600 nm为0.3的根癌农杆菌菌液浸泡7 min,再经过共培养2 d后转移到筛选分化培养基中进行培养,有利于获得辣椒抗性不定芽.通过对获得的10株抗性不定芽进行PCR检测,其中有2株扩增出目的条带,初步证明CMV-CP基因已经转入辣椒不定芽中.     

甜瓜CmCIPK家族全基因组鉴定和逆境条件下的表达分析

为探究甜瓜CIPK(CBL-interacting protein kinase)基因家族成员的生物学功能,以拟南芥中26个CIPKs的氨基酸序列为参照,用BLASTP方法鉴定了18个甜瓜CIPK家族成员,并对其理化性质、染色体分布、系统进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式元件,以及基因的表达模式进行了分析。结果显示,CIPK基因家族成员的基因长度为1 499~8 499 bp,它们不均匀地分布在甜瓜的9条染色体上;根据进化关系可将其分为5个亚家族,分别包含了26、10、25、26和8个成员,并且其中有4个CmCIPK基因对发生了片段复制。基因结构分析表明,10个基因为内含子缺失型,8个基因为内含子富集型。蛋白保守基序分析发现,CmCIPK家族保守性较好,所有成员均含有CIPK家族的典型特征:N端激酶域中的激活环和C端调节域中的NAF/FISL结构域。在基因上游的2 000 bp序列中存在多个与植物激素和逆境相关的顺式元件,显示可能有多种转录调控。转录组分析发现,CmCIPKs的组织表达量整体表现为叶>根>雄花>雌花>果。选择CmCIPK1-like和CmCIPK12-like基因验证其组织表达模式,显示分别在叶和雄花中的表达量最高。对其进行不同逆境处理,结果表明,这2个CmCIPK基因受NaCl和脱落酸(ABA)诱导表达;在干旱处理中,这2个基因经历短时间的上调或下调后恢复至最初表达水平。以上结果说明,CmCIPK1-like和CmCIPK12-like基因可能在ABA和非生物胁迫中发挥着重要作用,可为以后CmCIPK的功能研究提供参考。     

CRISPR-Cas9技术敲除甜瓜eIF4E基因表达载体的构建

【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。     

串联的人胸腺素α1基因在番茄中的高效表达

 【目的】提高免疫活性多肽人胸腺素α1（Tα1）在番茄中的表达量。【方法】根据植物偏爱密码子对Tα1基因进行优化,并将其顺式串联成四联体,同时在单体基因间插入肠激酶剪切位点基因序列,以便表达的融合蛋白可以被肠激酶切割成单体。利用农杆菌介导法将单体Tα1基因和四联体Tα1基因分别转化进入番茄。【结果】两个基因转化番茄后分别得到卡那霉素抗性再生植株19株和10株,PCR和Southern杂交检测证明,部分番茄基因组中整合了外源基因。经过Western和ELISA分析,串联的Tα1基因已经在番茄果实中表达,表达量最高相当于20.2 μg Tα1?g-1果实鲜重,高于单体基因的表达量。【结论】基因串联的方式提高了Tα1基因在番茄中的表达量。     

BTH诱导处理对新疆甜瓜植株过氧化物酶的诱导作用及对其同工酶的影响

BTH诱导处理新疆抗性不同的甜瓜植株,均能激发被诱导叶片(第一片真叶)过氧化物酶的显著升高,说明了甜瓜抗病性与甜瓜植株过氧化物酶活力呈正相关,也说明了BTH可以诱导甜瓜系统获得性抗性(SAR)的产生.经诱导处理的叶片作过氧化物酶同工酶的PAGE电泳,有新增谱带.