牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白表达检测

【目的】:uPA及uPAR系统在牛卵泡生长调节方面的研究会取得较大进展而有着广阔的应用前景。本实验探讨牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白定位与表达。【方法】:分别应用western blot及FITC免疫荧光方法检测牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白定位与表达。【结果】:Western blot及FITC免疫荧光方法检测发现uPA在牛未成熟卵丘细胞、卵泡内膜细胞和外膜细胞表达,uPA在牛卵母细胞不表达;并发现uPAR在牛未成熟卵丘细胞、卵泡内膜细胞和外膜细胞表达,uPAR在牛卵母细胞表达。【结论】:根据western blot及FITC免疫荧光方法的结果推测,uPA可通过结合牛卵丘细胞和卵母细胞上的uPAR调节卵泡的生长。     

绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。     

生长激素和胰岛素对体外培养猪COCs的影响

研究了生长激素(STH)和胰岛素(Insulin)对体外培养猪COCs卵母细胞成熟及孤雌激活后卵裂、卵丘细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响,结果表明:STH和Insulin对卵母细胞的成熟和激活后卵裂具有双重效应.培养液中添加适当浓度的STH(0.151μg·mL-1)或Insulin(51μg·mL-1)可提高卵母细胞成熟率和卵裂率,与对照组及其他试验组相比差异显著(P<0.05).在猪COCs体外成熟过程中,适当浓度STH和Insulin能抑制卵丘细胞凋亡,抑制Bax在卵丘细胞的表达.     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

 【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术(RT-PCR),对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

线粒体损伤对山羊-绵羊异种核移植胚早期发育的影响

【目的】研究线粒体损伤对核移植胚早期发育的影响。【方法】用经光敏化染料罗丹明-123损伤的山羊胎儿成纤维细胞和绵羊卵母细胞,构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,于38.5℃、相对湿度100%、体积分数5%CO2条件下培养,统计其2-细胞期、8-细胞期和囊胚期的发育率。【结果】山羊核供体线粒体损伤并不影响囊胚期前核移植胚的发育率(P0.05);绵羊卵母细胞线粒体损伤,使核移植胚2-细胞期的发育率下降(P0.05),但不影响8-细胞期和囊胚期的发育率(P0.05);核供体和卵母细胞线粒体都损伤的核移植胚发育率的变化规律与卵胞质受体线粒体损伤的核移植胚一致。【结论】在异种核移植胚的早期发育中,核供体线粒体损伤不影响核移植胚的发育,但卵母细胞受体线粒体损伤明显影响核移植胚的发育率。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卯中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术（RT—PCR）,对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

孕马血清促性腺激素对狗卵母细胞体外核成熟的影响

[目的]研究孕马血清促性腺激素(PMSG;eCG)对狗卵母细胞体外成熟效果的影响。[方法]采用切割法收集卵巢表面卵丘卵母细胞复合体(COCs),并且随机分为4组,在添加不同浓度的PMSG的基础培养液(含有10%胎牛血清的DMEM)中,5%CO2,38.5℃培养箱内培养48 h。在含有0.1%透明质酸酶的D-PBS中用细小玻璃管剥离卵丘细胞从而获得裸卵,为了鉴别核成熟期,用4%甲醛溶液固定裸卵15 min,然后用10μg/ml Hoechst33342染色、压片,荧光显微镜下观察核形态。[结果]体外培养48 h后,添加PMSG处理组卵丘扩散明显,但发育到MⅠ-MⅡ的比率都没有显著差异(P(0.05)。100 IU/ml PMSG处理组GVBD期率显著低于对照组。[结论]添加PMSG改善了卵丘扩散的效果,但是没有提高核成熟率,需进一步改进狗卵母细胞体外成熟率的培养体系。     

抗冻剂、CB和离心极化对猪GV期卵母细胞冷冻效率的影响

【目的】评价2种冷冻保护剂(EDS和EPS)、细胞松弛素B(CB)和离心极化处理对猪GV期卵母细胞冷冻效果的影响。【方法】分别应用EDS和EPS 2种冷冻保护剂、CB(设5.0,7.5和10.0μg/mL 3个水平)和离心极化处理,对猪卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,解冻后用台盼蓝染色法和Hochest33342染色法分析猪卵母细胞存活率及随后的成熟率。【结果】EPS组和EDS组冻融后的猪卵母细胞存活率和成熟率均无显著差异。以EPS作冷冻保护剂时,冻融后裸卵组的存活率显著高于COCs组(P<0.05)。7.5μg/mL CB处理组的裸卵存活率显著高于对照组(P<0.05);7.5μg/mL CB+离心极化处理组裸卵存活率与成熟率均显著高于CB单处理组和对照组(P<0.05)。【结论】同等条件下,猪GV期裸卵的冷冻效果好于COCs;CB或CB+离心极化均能改善GV期猪卵母细胞冷冻效果。     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

颗粒细胞和培养微滴大小对牛卵母细胞体外受精后胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为材料,研究了颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类,分别在体外成熟(IVM)和早期胚胎的体外培养(IVC)培养液中添加GCM,与不添加的对比;添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率无明显影响,但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。试验2将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴(30μl,50μl,100μl和200μl)中培养、受精,30μl和50μl组的囊胚发育率明显高于100μl和200μl组。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

[目的]探究伏马毒素B,(fumonisin B1,FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制,为临床有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供理论参考.[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB1(0、10、...     

牛-山羊异种体细胞克隆胚胎线粒体形态超微结构观察#br#

 【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚胎从2-细胞胚胎至桑椹胚都存在一种具有多个分叶的线粒体,但这种形态异常的线粒体同样也能够形成电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体。【结论】牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作,本研究中具体表现为出现多分叶形线粒体,从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的发育。     

牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养

【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）和牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast,BEF）,用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA 表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。     

外源褪黑素对牛卵母细胞体外成熟的影响

 【目的】探索外源褪黑素（melatonin,MT）处理对牛卵母细胞体外成熟的影响从而优化牛体外胚胎生产体系。【方法】在牛卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT,观察并统计其体外受精后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。应用放射免疫分析法检测血清、卵泡液和成熟培养液内MT与孕酮（P）、雌激素（E2)、促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平的变化并检测卵母细胞的活力和活性氧（ROS）的浓度。【结果】存在于牛卵泡液中的MT浓度与血清中的相近,添加10-11 mol•L-1 MT组的P浓度（2.01±0.33）ng•mL-1显著高于对照组（（0.87±0.10）ng•mL-1,P＜0.05）。与对照组（（67.32±7.30）%）相比,10-9 mol•L-1 MT组卵裂率显著提高（（77.81±7.06）%,P＜0.05）,并能提高囊胚率且囊胚细胞数（（29.61±9.55）%,（90.30±28.74）个）,显著高于对照组（（19.64±9.22）%,（75.07±25.98）个,P＜0.05）;同时,10-9 mol•L-1 MT组卵母细胞的活力高于对照组,并能降低卵母细胞内的ROS含量但没有显著差异（P＞0.05）。【结论】牛卵泡液中存在MT,适当浓度的外源MT能促进牛卵母细胞体外成熟。     

EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用

【目的】探明表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体（EGFR）在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态,并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢,捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）,进行体外成熟培养;分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态;牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·mL^-1 EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib,比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs 的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞,卵母细胞表达较弱。100 ng·mL^-1 EGF可以显著提高COCs成熟率（73.45±2.09）%及其受精后的卵裂率（59.46±1.41）%和囊胚率（26.23±1.08）%;对照组中（0 EGF）COCs成熟率为(54.16±3.25)%,卵裂率为 (48.33±1.93)%,囊胚率为(15.34±0.43)%;EGF浓度为50 ng·mL^-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·mL^-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达,在50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相对表达量分别仅为对照组（0 EGF）的0.83±0.12,0.21±0.02,0.27±0.03倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Bax基因表达量最低,而Gefitinib作用后可以显著促进成熟COCs中Bax基因的表达,其相对表达量为对照组的4.24±0.10倍;EGF在COCs成熟过程中可以显著促进抗凋亡基因Baxi的表达,其相对表达量在EGF浓度为50、100、200 ng·mL^-1EGF分别为对照组的2.18±0.12、7.06±0.59和6.73±0.31倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Baxi基因表达量最高,而Gefitinib作用后可以显著降低成熟COCs中Baxi基因的表达,其相对表达量为对照组的0.32±0.04倍。【结论】EGF和EGFR作为牦牛COCs体外成熟过程中重要的自分泌因子,且外源的EGF可以显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率,最佳作用浓度为100 ng·mL^-1,其作用机制可能与调控凋亡相关基因Bax和Baxi表达有关。     

瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响

[目的]探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础.[方法]分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响.[结果]在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10 ng/mL.在最佳瘦素浓度(10 ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7%(空白对照组)提高到27.0%,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3%(空白对照组)提高到17.4%.[结论]瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10 ng/mL瘦素的促进效果最明显.