绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。     

普安县长毛兔出巢仔兔的饲养管理

综述了贵州省普安县的气候,出巢仔兔的生理、营养需要、行为等特点,出巢仔兔对环境、营养、产仔箱、饮水器及球虫病预防的基本需求。总结了出巢仔兔的哺乳方法,开食料的基本要求,开食料的配方、开食时间及开食时增加运动的技巧;兔舍的环境控制及卫生要求,母兔的管理,产箱的管理,不及时回巢的仔兔的护理,及时断乳等管理措施。认为搞好出巢仔兔的饲养管理,是提高断奶成活率,降低幼兔死亡率,提高繁殖率的关键之一。     

巨高长毛兔母兔排粪、排尿、睡觉的位置观察

观察440只巨高长毛兔母兔的睡觉、排尿、排粪的位置。结果显示:母兔100%定点排粪,68.2%的母兔尿排在饮水器漏水区之外,51.4%的兔粪被兔尿和饮水器漏出的水浸泡。要保证兔粪在承粪板上不被浸湿,需要人为调整母兔的排尿地点,有必要开展母兔定点排粪、排尿、睡觉的"母兔三定训练"。在自然状态下,80%的母兔睡觉时头朝外,89.3%的母兔睡觉时身体为纵向。母兔在睡觉时警觉性最高,容易炸群;为预防脚皮炎的发生,笼底板应设计为纵向。     

普安县长毛兔产业发展状况与前景分析

综述了普安县长毛兔产业发展的优势、发展现状及长毛兔市场的前景。指出长毛兔产业投资少,见效快,是典型的增加农民收入的短、平、快项目,长毛兔养殖需走产业化、规模化道路,满足未来市场需要。     

长毛兔的剪毛技巧

简述了长毛兔剪毛的基本操作方法,从长毛兔种群结构分别介绍了幼兔、商品长毛兔、繁殖母兔及种公兔具体的剪毛事项。     

万寿菊花渣作为长毛兔饲料的可行性

综述了万寿菊花渣资源、应用现状、加工工艺、功效、营养成分、作为饲料的优点、参考使用量等。认为万寿菊花渣作为替代部分长毛兔纤维素饲料具有可行性。     

中华芦荟快繁技术研究

实验通过诱导愈伤组织和促进腋芽分枝能力两种途径对中华芦荟进行快繁。结果表明:在MS培养基中加入600mg/L的抗坏血酸可有效预防外植体的褐化。愈伤组织诱导途径中由叶诱导愈伤组织阶段和愈伤组织诱导芽阶段的最佳PGR种类和浓度配比分别为2mg/L6-BA+1.7mg/L2,4-D、4mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;促进腋芽分枝能力方式中腋芽诱导丛生芽阶段的最佳PGR种类和浓度配比为2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;由芽诱导生根阶段最佳PGR种类和浓度配比为0.3mg/LNAA。促进腋芽分枝能力方式比诱导愈伤组织方式更适合中华芦荟的快速繁殖。     

uPA对体外成熟牛卵母细胞生发泡破裂的影响

为了探明尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)对体外成熟牛卵母细胞核成熟的可能作用,试验根据uPA及其特异性抑制剂(amiloride)的有效浓度分成4组,即对照组、uPA(0.5 ng/mL)组、amiloride(1μg/mL)组及联合添加(uPA+amiloride)组,然后采用地衣红染色方法分别研究体外成熟培养6 h与12 h后uPA对牛卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的影响,采用ELISA方法研究体外成熟培养6 h后uPA对牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中cAMP水平变化的可能调节作用。结果表明:减数分裂不同时期(GV期、GVBD期及MⅠ~MⅡ期)卵母细胞染色质(体)形态呈现不同特征。卵母细胞在体外成熟培养6 h后各组细胞均处于GV~GVBD期,其中uPA组GVBD期卵母细胞率(12.72%)显著低于对照组(24.83%)与联合添加组(30.42%,P0.05);体外成熟培养12 h后,uPA组GVBD期卵母细胞率(54.81%)显著高于对照组(37.49%)与联合添加组(25.64%,P0.05),uPA组MⅠ~MⅡ期卵母细胞率(44.85%)显著低于对照组(62.51%)与联合添加组(74.36%,P0.05);体外成熟培养6 h后,uPA组cAMP水平显著高于对照组与联合添加组(P0.05)。说明uPA通过上调cAMP水平阻滞牛卵母细胞的减数分裂进程。     

uPA对体外培养牛卵丘颗粒细胞周期变化与凋亡的影响

探讨uPA对体外培养牛卵丘颗粒细胞周期与凋亡的影响。在建立稳定传代的牛卵丘颗粒细胞体外培养体系的基础上,利用细胞周期检测技术,探讨了尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator,uPA)活性对调节体外培养牛卵丘颗粒细胞周期的变化和凋亡的的影响。试验结果表明Amiloride能显著增加处于S和G2/M期的细胞比率,且对细胞凋亡没有影响。本研究结果对于进一步深入理解牛卵泡发育与闭锁机制有重要意义。