绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。     

uPA对体外成熟牛卵母细胞生发泡破裂的影响

为了探明尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)对体外成熟牛卵母细胞核成熟的可能作用,试验根据uPA及其特异性抑制剂(amiloride)的有效浓度分成4组,即对照组、uPA(0.5 ng/mL)组、amiloride(1μg/mL)组及联合添加(uPA+amiloride)组,然后采用地衣红染色方法分别研究体外成熟培养6 h与12 h后uPA对牛卵母细胞生发泡破裂(GVBD)的影响,采用ELISA方法研究体外成熟培养6 h后uPA对牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中cAMP水平变化的可能调节作用。结果表明:减数分裂不同时期(GV期、GVBD期及MⅠ~MⅡ期)卵母细胞染色质(体)形态呈现不同特征。卵母细胞在体外成熟培养6 h后各组细胞均处于GV~GVBD期,其中uPA组GVBD期卵母细胞率(12.72%)显著低于对照组(24.83%)与联合添加组(30.42%,P0.05);体外成熟培养12 h后,uPA组GVBD期卵母细胞率(54.81%)显著高于对照组(37.49%)与联合添加组(25.64%,P0.05),uPA组MⅠ~MⅡ期卵母细胞率(44.85%)显著低于对照组(62.51%)与联合添加组(74.36%,P0.05);体外成熟培养6 h后,uPA组cAMP水平显著高于对照组与联合添加组(P0.05)。说明uPA通过上调cAMP水平阻滞牛卵母细胞的减数分裂进程。     

uPA对体外培养牛卵丘颗粒细胞周期变化与凋亡的影响

探讨uPA对体外培养牛卵丘颗粒细胞周期与凋亡的影响。在建立稳定传代的牛卵丘颗粒细胞体外培养体系的基础上,利用细胞周期检测技术,探讨了尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator,uPA)活性对调节体外培养牛卵丘颗粒细胞周期的变化和凋亡的的影响。试验结果表明Amiloride能显著增加处于S和G2/M期的细胞比率,且对细胞凋亡没有影响。本研究结果对于进一步深入理解牛卵泡发育与闭锁机制有重要意义。     

6天龄与10天龄大鼠的睾丸组织的基因差异表达

通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司制作的大鼠12×135K全基因组表达谱芯片,对日龄为6d和10d的大鼠睾丸组织进行全基因组表达差异分析。结果显示：具有2倍以上的差异表达基因有4298个,其中表达上调的基因共1878个,表达下调的基因共2420个。这些差异表达的基因中有3154个基因具有基因本体注释,参与了154个生物学通路。进一步分析表明具有8倍以上差异表达的基因有13个,这些基因参与了生物学过程、细胞组分和分子功能等基因本体分类,进一步选择3个差异表达的基因,LOC686076、Cxcl6和Trib3,做了实时定量RT-PCR检测。其结果趋势与芯片数据一致。因此,我们初步认为精原干细胞的发生与增殖在大鼠早期的发育过程中已经有大量的基因参与,是一个多基因协调表达的过程。     

DHEA诱导小鼠PCOS模型过程中性激素的变化规律

【目的】 鉴于在多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)发病机理和治疗方式上的诸多争议，以及使用人类PCOS材料进行研究的局限性，本研究通过构建PCOS小鼠模型以探究在模型构建过程中性激素水平的变化规律。【方法】 皮下注射脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)诱导昆明白雌鼠产生PCOS样临床症状，通过结晶紫染色查看小鼠性周期是否发生停滞；利用HE染色的方式确定卵巢发育状况；利用ELISA技术调查建模过程中血清睾酮和雌二醇浓度的变化规律。【结果】 使用结晶紫对小鼠阴道上皮细胞染色可准确区分小鼠各个性周期阶段；使用6 mg/100 g DHEA持续诱导20 d后，昆明白小鼠性周期循环发生了一定的停滞，且在建模过程中体重变化与芝麻油溶剂的加入呈显著相关(P < 0.05)，与DHEA处理无关；DHEA连续处理后可见卵巢中巨大囊状卵泡出现，血清睾酮水平出现显著升高(P < 0.05)；自PCOS模型构建的第5天起，血清睾酮水平显著上升(P < 0.05)，且维持到建模结束；而血清雌二醇水平出现了阶段性变化，在第10、15天均显著高于对照组(P < 0.05)，第20天时低于对照组。【结论】 改进DHEA溶解方式可成功构建昆明白小鼠PCOS模型，在建模过程中血清睾酮持续处于较高水平，而雌二醇水平呈现先增高后降低的趋势，后者在建模中期瞬时升高的病理意义需进一步研究。     

双氢睾酮对小鼠卵泡颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素表达的影响

【目的】探讨双氢睾酮(DHT)对小鼠颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素(AMH)表达的影响。【方法】给3周龄的昆明小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG,10 IU/只)以获取颗粒细胞,颗粒细胞传代后48 h HE染色鉴定形态,绘制颗粒细胞的生长曲线,免疫荧光法鉴定促卵泡素受体(FSHR)的表达。当第2代颗粒细胞汇合度达到50%时,先用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h,然后在培养基中添加不同浓度的DHT (0、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L),培养48 h后检测颗粒细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法及ELISA法分别测定AMH基因及蛋白的表达。在颗粒细胞培养液中分别添加10^-6 mol/L Flutamide (雄激素受体(AR)特异性抑制剂)、10^-7 mol/L DHT、10^-7 mol/L DHT+10^-6 mol/L Flutamide、10^-5 mol/L DHT、10^-5mol/L DHT+10^-8 mol/L 11-ketodihydrotestosterone (AR特异性激动剂),分别记为F、D7、DF、D5、DK组,以不添加药物为对照组。培养48 h后,检测各组颗粒细胞增殖及AMH蛋白含量。【结果】体外培养的小鼠颗粒细胞呈梭形或铺路石状,生长曲线呈S形,细胞普遍表达FSHR;与0 mol/L DHT组相比,10^-8、10^-7 mol/L DHT组细胞增殖分别显著和极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),10^-5 mol/L DHT组细胞增殖显著降低(P＜0.05);10^-7 mol/L DHT组AMH基因的相对表达量和AMH蛋白含量均极显著增加(P＜0.01)。与D7组相比,DF组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著降低(P＜0.01);与D5组相比,DK组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著升高(P＜0.01)。【结论】10^-7 mol/L DHT能够显著促进颗粒细胞增殖和AMH表达,而10^-5 mol/L显著降低了颗粒细胞增殖以及AMH表达,且AR介导了DHT调控颗粒细胞增殖和AMH表达。