卵丘细胞凋亡与增殖对牛卵母细胞体外发育的影响

 【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体（COCs）形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】 与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】 卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率指标可以用来指示未成熟卵母细胞的发育潜力。     

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原（PCNA）参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示：原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示：PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异（43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219 , P<0.01）;【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。     

牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白表达检测

【目的】:uPA及uPAR系统在牛卵泡生长调节方面的研究会取得较大进展而有着广阔的应用前景。本实验探讨牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白定位与表达。【方法】:分别应用western blot及FITC免疫荧光方法检测牛未成熟卵丘-卵母细胞中uPA和uPAR蛋白定位与表达。【结果】:Western blot及FITC免疫荧光方法检测发现uPA在牛未成熟卵丘细胞、卵泡内膜细胞和外膜细胞表达,uPA在牛卵母细胞不表达;并发现uPAR在牛未成熟卵丘细胞、卵泡内膜细胞和外膜细胞表达,uPAR在牛卵母细胞表达。【结论】:根据western blot及FITC免疫荧光方法的结果推测,uPA可通过结合牛卵丘细胞和卵母细胞上的uPAR调节卵泡的生长。     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系①

本实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）,于注射HCG后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射HCG后1 h,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂（GVBD）;注射HCG后3 h,大部分(＞70%)大有腔卵泡中卵母细胞发生GVBD,此时卵丘处于2级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射HCG后9 h,而PB1的排出是从12　h开始的。结果表明在小鼠体内,卵丘开始扩展先于卵母细胞成熟,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展;促性腺激素能促进卵泡发育及卵母细胞成熟,同时也具有促使卵泡退化的功能。     

促卵泡素对犬卵母细胞体外成熟的影响

为探究基础培养基中添加促卵泡素(FSH)对犬卵母细胞体外成熟的影响,采用切割法收集卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(COCs),培养在添加不同浓度FSH(0,0.1,1,10 IU/mL)的TCM-199基础培养液中.体外培养72 h后,对卵母细胞进行染色观察其细胞核成熟情况.结果表明,FSH的添加没有增加犬卵母细胞恢复减数分裂的细胞数量.此外,不同处理对卵母细胞卵丘扩散无差异.     

表皮生长因子受体在绵羊卵巢中的表达

收集成年绵羊卵巢标本,采用免疫组织化学的方法检测EGFR蛋白在绵羊卵巢组织中的表达情况。研究结果表明,在绵羊卵巢中EGFR蛋白的表达具有时空特异性,它集中分布在发育各阶段的卵泡颗粒细胞中,并随卵泡的发育程度表现出表这量的差异。本研究说明EGFR与其配体EGF结合具有刺激颗粒细胞增殖分化、促进卵丘扩展和刺激卵母细胞成熟的功能。     

受精液种类、卵丘细胞及卵巢保存温度对奶牛体外受精效果的影响

为了提高奶牛体外受精效果,研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO和TALP三种体外受精液中的受精效果,同时比较了裸卵(NOs)与卵丘卵母细胞复合体(COCs)对受精效果的影响,卵巢的不同保存温度对卵母细胞受精效果的影响。结果显示,体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液的(P0.05),而TALP液中的卵裂率与IVF-100和BO液的差异都不显著(P0.05);裸卵(NOs)的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体(COCs),但差异不显著(P0.05);NOs的囊胚率极显著低于COCs的(P0.01);卵巢在10和37℃下保存2~3 h,卵母细胞卵裂率和囊胚率差异均不显著(P0.05)。     

p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系

【目的】 研究p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达特征及其与卵母细胞胞质氧化还原稳态的关系,为揭示p66Shc参与调控卵母细胞胞质氧化还原稳态分子机制提供理论依据。【方法】 试验所用卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes, COCs）来源于屠宰场的绵羊卵巢。分别收集成熟前优质和劣质、常规成熟24 h及成熟30 h老化的卵母细胞,采用实时荧光定量PCR对成熟前后不同质量绵羊卵母细胞中p66Shc mRNA的表达量进行分析,利用细胞免疫荧光结合MitoTracker Red探针对p66Shc蛋白和线粒体进行共定位,同时利用荧光探针DCFH-DA和卵母细胞自发荧光分别对成熟前后不同质量卵母细胞内ROS水平和氧化还原稳态进行检测。此外,采用外源H₂O₂诱导的氧化应激处理成熟前优质卵母细胞,并对p66Shc蛋白的表达及定位进行了检测分析。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA表达量分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。然而优质卵母细胞成熟前后p66Shc mRNA表达量没有显著差异（P>0.05）。共定位结果表明,p66蛋白主要分布在线粒体分布活跃的区域。细胞免疫荧光结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc蛋白表达量也分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态的失衡。此外,与未添加外源H₂O₂的对照组相比,外源H₂O₂处理成熟前优质卵母细胞诱导的氧化应激显著（P<0.05）上调p66Shc蛋白的表达并促使 p66Shc由胞质向细胞核定位。【结论】 p66Shc基因在劣质和老化的绵羊卵母细胞中呈现高水平的表达,H₂O₂诱导的氧化应激显著上调p66Shc蛋白的表达并影响其亚细胞定位。总之,绵羊卵母细胞中p66Shc表达上调影响了胞质的氧化还原稳态。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

 【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术(RT-PCR),对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系

三实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素,４８ｈ后注射人绒毛膜促性腺激素,于注射ＨＣＧ后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射ＨＣＧ后１ｈ,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂;注射ＨＣＧ后３ｈ,大部分大有腔卵泡中卵母细胞发生ＧＶＢＤ,此时卵丘处于２级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射ＨＣＧ后９ｈ,     

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下,回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理,同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢,观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精,观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后,未处理组移植体回收率为85.4%,与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段,回收卵母细胞均处在GV期,平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚,2-细胞胚胎发育率为17.5%,未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成,有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体,平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚,其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚,GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%,囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05）,2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01）,处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,但不增加卵母细胞产量。     

超数排卵效果不同绵羊卵巢卵泡促卵泡素受体的分布

 【目的】探讨在具有不同超数排卵效果的绵羊品种中,进行超排处理后其卵巢上促卵泡素受体(FSH receptor,FSHR)的分布情况,为进一步研究二者的相关性及据此改进超排效果奠定基础。【方法】根据超数排卵效果优劣依次选择3个中国地方品种的绵羊：小尾寒羊、白滩羊和乌珠穆沁羊。在常规超排最后一次注射FSH后的8、16和24 h分别各取3只绵羊的卵巢,并采用免疫组织化学法观察3种绵羊卵巢上FSHR的分布情况。【结果】FSHR主要分布于3个品种绵羊卵巢的颗粒细胞上;小尾寒羊最后一次注射FSH后8、16和24 h的各时期卵泡中FSHR的表达都显著高于另外两个品种绵羊(P＜0.05),在早期卵泡和中期卵泡中,白滩羊的FSHR表达量也高于乌珠穆沁羊;3个品种绵羊在最后一次注射FSH后第8、16、24小时,其晚期卵泡FSHR表达阳性率都显著高于各自相应的早期和中期卵泡(P＜0.05)。【结论】推测出3个不同地方品种绵羊的卵巢对FSH处理的敏感性应该依次为：小尾寒羊＞白滩羊＞乌珠穆沁羊,表明绵羊超数排卵效果与其卵巢上FSH受体分布存在一定联系。     

绵羊不同直径卵泡卵母细胞特征及染色体形态分析

[目的]剥离不同直径卵泡卵母细胞,比较卵母细胞成熟前后的特征.[方法]测量绵羊卵巢表面卵泡直径后进行剥离,研究卵泡表面直径与卵泡实际直径之间的关系.按表面直径分组(1.0 mm以下、1.0～2.0mm、2.1～4.0 mm、4.1 mm以上),比较各分组间卵母细胞透明带厚度、卵丘复合体质量、卵母细胞成熟前后的染色体形态变化的差异.[结果]随着卵泡直径的增大,卵泡实际直径差异极显著(P＜0.01);各组间透明带厚度差异不显著(P＞0 05),但有降低的趋势;卵丘复合体质量分为A级、B级和C级,A级有增加的趋势,B级C级有降低的趋势;卵母细胞成熟后GV/GVBD比率有下降的趋势,MAT -I、NII有增加的趋势.[结论]随着卵泡直径增大,未成熟卵母细胞的质量提高,卵母细胞核成熟比例增加.     

AREG对绵羊卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

为研究双调蛋白(AREG)对绵羊卵丘细胞(Cumulus cells,CCs)葡萄糖代谢的影响,采集来源于中腔卵泡和小腔卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),利用荧光定量PCR检测中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达;添加AREG进行卵丘细胞的体外培养和卵母细胞的体外成熟(IVM),检测卵丘细胞的增殖,测定培养液或细胞中的葡萄糖、乳酸、NADPH和ATP含量。结果表明:1)来源于小腔卵泡的卵丘细胞G6PDH、PFKL和PFKM的mRNA表达量以及细胞增殖能力显著低于中腔卵泡卵丘细胞(P<0.05);2)较低浓度(10 ng/mL)的AREG显著提高了中腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(P<0.05)而对小腔卵泡卵丘细胞无影响(P>0.05),在生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)的协同作用下,10 ng/mL AREG可以显著提高两者的增殖能力(P<0.05)且两者间差异不显著(P>0.05);3)在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可显著提高不同直径腔卵泡卵丘细胞培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成、NADPH生成以及细胞中的ATP含量(P<0.05);4)小腔卵泡卵母细胞的IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15,显著提高培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成及卵丘细胞中的ATP含量(P<0.05)且显著高于中腔卵泡(P<0.05),显著提高了卵母细胞中的NADPH生成及ATP含量(P<0.05)且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P>0.05)。综上,在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可以增强绵羊卵丘细胞的葡萄糖代谢,并且对进行IVM的小腔卵泡COCs添加AREG+GDF9+BMP15可使其葡萄糖代谢达到中腔卵泡的水平。     

卵泡大小及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

 以屠宰场牛卵巢为材料，研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1：按照卵泡大小将卵丘卵母细胞复合体（COCs）分为4个试验组：＞8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前3种卵母细胞混合）组。结果表明，卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育，同时，源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养，可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。试验2：将源自优势卵泡（＞8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF），按照10%添加到成熟培养液中，3个试验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05)，但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连，易于造成丢失。试验3：与未添加BFF的对照组相比，成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF，均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05)，但20%组和40%组出现卵母细胞及胚胎粘连。因此，成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。     

绵羊RARG基因在发情不同阶段卵巢中的mRNA表达

【目的】分离鉴定绵羊视黄酸受体-γ（Retinoic acid receptor gamma,RARG）基因,分析该基因的分子特征,研究其在发情周期不同阶段卵巢中的表达差异。【方法】选取年龄和体况相近、健康的甘肃高山细毛羊周岁母羊8只,通过同期发情处理,根据卵巢生理状态,将其分为两组：黄体期组和卵泡期组,各4只,屠宰后,采集卵巢组织,以周岁母羊卵巢组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增绵羊RARG基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证。利用ORF Finder和DNAStar等生物信息学软件分析绵羊RARG基因的理化性质、同源性和预测结构域和功能。利用Q-PCR技术,检测绵羊RARG基因在母羊发情周期不同阶段卵巢组织中的相对表达量,用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨RARG基因对绵羊发情周期的调控机制。【结果】获得了绵羊RARG基因包含完整编码区序列在内的1 588 bp的绵羊RARG基因序列,并提交至NCBI,GenBank登录号为KF019682。该序列含有1个1 377 bp的完整开放阅读框（Open reading frame,ORF）,编码458个氨基酸,其蛋白分子质量为50 955.8 D,理论等电点为7.45。绵羊RARG基因与牛、普通狨、家犬、仓鼠、家猫、人、小鼠、虎鲸、狒、家鼠、野猪、海牛、海豚和蟾蜍等14个物种的同源性分析,结果显示RARG基因在上述物种间高度保守,且与牛的亲缘关系较近,序列同源性最高。GO功能分析结果显示,绵羊RARG基因作为结构蛋白参与转录调控的几率最高,分别为0.272和0.223。在绵羊RARG基因编码的氨基酸序列上发现了2个功能结构域,分别是核激素受体c4锌指结构域（c4 zinc finger in nuclear hormone receptors,ZnF_C4）和 激素受体配体结构域（ligand binding domain of hormone receptors,HOLI）。Q-PCR结果显示,绵羊RARG mRNA 在甘肃高山细毛羊卵泡期卵巢中的相对表达量显著高于黄体期（P<0.05）。【结论】绵羊RARG基因在物种间高度保守,含有ZnF_C4和HOLI等2个与转录调控相关的功能结构域,推测该基因可能作为一种重要的转录因子参与母羊发情周期调控。