猪卵丘卵母细胞复合体和裸卯中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术（RT—PCR）,对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

Gdf9、Zar1、Mater、Dnmt1 mRNA在绵羊卵母细胞复合体、裸卵及卵丘细胞中的表达

为了探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进绵羊卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理.本研究对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的绵羊卵母细胞进行了体外成熟培养试验,以不同方式处理卵丘细胞,应用Rael-time PCR技术,检测母源基因Gdf9(生长分化因子9),Zar1(合子阻滞因子1),Mater(胚胎必要的母体抗原),Dnmt1(DNA甲基化酶1)在不同卵母细胞和卵丘细胞中mRNA的含量.结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于24h成熟培养的卵母细胞(P＜0.05),除Dnmt1外其他3个基因在致密卵丘细胞包裹的卵母细胞的表达量均高于自然裸卵(DOs) (P ＜0.05),Zar1和Mater在24h卵丘-卵母细胞复合体的表达量低于24h裸卵(P＜0.05),除Dnmt1外其他3个基因在24h共成熟卵丘细胞中表达量均高于未培养的卵丘细胞(P＜0.05).结果提示,这4个母源基因对卵母细胞成熟有重要影响,且可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,本研究结果为提高卵母细胞的体外成熟效率提供了依据及理论基础.     

绵羊卵丘细胞直径与卵母细胞质量的相关性

利用RT-PCR方法,检测不同直径绵羊卵泡卵丘细胞中FSHR、EGFR、GHR、b FGF、CYP19A、AMH基因的mRNA表达规律及卵母细胞孤雌激活后胚胎发育的影响,结果表明,大、中、小卵泡卵丘细胞中都有FSHR、EGFR、GHR、b FGF、CYP19A、AMH的mRNA表达,不同直径卵泡卵丘细胞呈现递增趋势,大卵泡卵丘细胞与中小卵泡的卵丘细胞相对表达量差异显著(P0.05);AMH在直径5.0 mm的卵泡卵丘细胞中有所下降。不同大小卵泡卵母细胞经体外培养,结果表明,各卵泡卵母细胞直径组间成熟率不显著,随卵泡直径的增大卵裂率增加,1.0~2.0 mm组与2.1~5.0 mm组卵裂率都显著低于5 mm组(P0.05),相互间无差异(P0.05);囊胚率也呈现逐渐增加的趋势,卵泡大于5.0 mm卵母细胞组极显著高于1.0~2.0 mm组(P0.01),2.1~5.0 mm组(P0.05)。证实卵丘细胞在绵羊卵母细胞成熟和受精及随后的胚胎发育过程中起重要作用,卵泡直径对卵母细胞发育能力产生影响。     

白细胞介素6及其受体在绵羊卵母细胞成熟过程中的表达

采用实时定量PCR技术检测了不同成熟培养时间绵羊卵母细胞和卵丘细胞白细胞介素6基因（interleukin-6 gene, IL-6）及其受体基因（interleukin-6 receptor gene, IL-6R）mRNA的相对表达量。结果显示,在体外成熟培养过程中,卵母细胞和卵丘细胞中持续表达IL-6及其受体IL-6R mRNA,培养4~8 h,其相对表达量呈现显著升高,随后则降低;在16~20 h时卵母细胞中IL-6 mRNA表达重新升高;相应的卵丘细胞在12~16h时IL-6R mRNA表达也升高。绵羊卵母细胞和卵丘细胞中IL-6和IL-6R mRNA的持续表达以及动力学变化提示了白细胞介素6在卵母细胞成熟过程中具有潜在调控作用。     

卵丘细胞凋亡与增殖对牛卵母细胞体外发育的影响

 【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体（COCs）形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】 与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】 卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率指标可以用来指示未成熟卵母细胞的发育潜力。     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

神经生长因子对猪卵丘细胞扩散及卵母细胞体外成熟的影响

利用光学显微镜观察及地衣红染色方法,探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加神经生长因子(NGF对猪卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟的影响.结果表明:在猪卵母细胞体外成熟过程中添加NGF对猪卵丘细胞扩散无明显影响;单纯添加NGF并不能显著改变第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的比率,但却可以显著提高生发泡期(GV期)卵母细胞比率.当NGF与促性腺激素(eCG和hCG)联合作用时,MⅡ期卵母细胞比率相对于单纯地促性腺激素作用有显著提高.     

猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟关系的研究

 以猪卵丘卵母细胞复合体（COC）为实验对象研究了猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟之间的关系,结果表明,（1）全程培养均暴露于激素环境中不利于卵丘的扩展;（2）卵丘扩展良好与卵丘扩展不好的卵母细胞核成熟比例无统计学差异（P>005）;（3）去除卵母细胞的COC培养后,卵丘细胞仍然能发生扩展;（4）培养24h后去掉COC的卵丘细胞不仅不影响卵母细胞的核成熟,而且极体完整的卵母细胞数目还显著增多（P<0.01）;但去颗粒细胞组卵母细胞的质膜不如对照组光滑;（5）带有壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）的COC扩展情况明显优于不带MGC的,其中含有极体的成熟卵数也显著高于后者（P<0.01）。     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响

【目的】探讨不同质量浓度的左旋肉碱对猪卵母细胞体外成熟、脂肪代谢和孤雌胚胎发育的影响.【方法】在成熟培养液中添加不同质量浓度左旋肉碱,观察其对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,并利用油红染色、三酰甘油定量试剂盒和定量RT-PCR技术检测其对卵母细胞脂肪代谢及其关键水解酶表达水平的影响.【结果和结论】在成熟液中添加100 ng/mL左旋肉碱能极显著促进猪卵母细胞的脂肪滴代谢(P0.001),并显著提高猪卵母细胞体外成熟率和孤雌激活囊胚发育率(P0.05);在胚胎培养液中添加100 ng/mL左旋肉碱能够显著提高猪孤雌胚胎卵裂率(P0.05),其囊胚率和囊胚质量均有提高的趋势;通过定量RT-PCR进一步发现100 ng/mL左旋肉碱极显著降低猪卵母细胞中激素敏感脂肪酶基因(HSL,P0.01)和三酰甘油水解酶基因(ATGL,P0.001)的mRNA表达水平,表明左旋肉碱能够影响调控脂肪代谢关键酶基因的表达.试验结果表明,左旋肉碱具有促进猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的作用,其可能是通过调控脂肪代谢来实现的.     

p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达及其与胞质氧化还原稳态的关系

【目的】 研究p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达特征及其与卵母细胞胞质氧化还原稳态的关系,为揭示p66Shc参与调控卵母细胞胞质氧化还原稳态分子机制提供理论依据。【方法】 试验所用卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes, COCs）来源于屠宰场的绵羊卵巢。分别收集成熟前优质和劣质、常规成熟24 h及成熟30 h老化的卵母细胞,采用实时荧光定量PCR对成熟前后不同质量绵羊卵母细胞中p66Shc mRNA的表达量进行分析,利用细胞免疫荧光结合MitoTracker Red探针对p66Shc蛋白和线粒体进行共定位,同时利用荧光探针DCFH-DA和卵母细胞自发荧光分别对成熟前后不同质量卵母细胞内ROS水平和氧化还原稳态进行检测。此外,采用外源H₂O₂诱导的氧化应激处理成熟前优质卵母细胞,并对p66Shc蛋白的表达及定位进行了检测分析。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA表达量分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。然而优质卵母细胞成熟前后p66Shc mRNA表达量没有显著差异（P>0.05）。共定位结果表明,p66蛋白主要分布在线粒体分布活跃的区域。细胞免疫荧光结果显示,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc蛋白表达量也分别显著（P<0.05）高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞。与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态的失衡。此外,与未添加外源H₂O₂的对照组相比,外源H₂O₂处理成熟前优质卵母细胞诱导的氧化应激显著（P<0.05）上调p66Shc蛋白的表达并促使 p66Shc由胞质向细胞核定位。【结论】 p66Shc基因在劣质和老化的绵羊卵母细胞中呈现高水平的表达,H₂O₂诱导的氧化应激显著上调p66Shc蛋白的表达并影响其亚细胞定位。总之,绵羊卵母细胞中p66Shc表达上调影响了胞质的氧化还原稳态。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小     

Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达

【目的】探讨Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达及二者表达与FSH之间的关系。【方法】 利用实时定量RT-PCR技术检测体外成熟进程中牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA水平表达变化,观察不同浓度FSH对Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达的作用以及FSH与FSH受体抑制剂的组合对Ghrelin和GHS-R1a基因表达的影响。【结果】 实时定量RT-PCR结果揭示牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA的相对表达量随着成熟过程的延长而呈现一定变化规律,即Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中从8 h开始显著下降并持续此低表达水平到24 h;不同浓度FSH 显著抑制卵母细胞Ghrelin及GHS-R1a mRNA的表达,而FSH 受体抑制剂明显减弱FSH的抑制作用而促进二者表达。【结论】Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中的表达可能随着培养液中FSH升高而降低。     

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

[目的]探究伏马毒素B,(fumonisin B1,FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制,为临床有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供理论参考.[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB1(0、10、...     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

EGF、EGFR在牦牛卵母细胞中的表达及对胚胎发育能力的作用

【目的】探明表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）及其受体（EGFR）在牦牛卵母细胞成熟过程中的表达动态,并且研究EGF对牦牛卵母细胞成熟的影响及可能的分子作用机制。【方法】采集牦牛卵巢,捡取质量较好的牦牛卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes,COCs）,进行体外成熟培养;分别处理未成熟和成熟的牦牛COCs,采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟过程中EGF及EGFR在基因和蛋白水平的表达动态;牦牛COCs成熟培养时在基础培养基中分别添加0、50、100和200 ng·mL^-1 EGF及最佳作用浓度的EGFR抑制因子Gefitinib,比较作用前后卵母细胞成熟率、受精后卵裂率及囊胚率;Real-time PCR方法分析不同浓度EGF和Gefitinib作用后成熟COCs中凋亡相关基因Bax和Baxi的相对表达量。【结果】EGF,EGFR基因在成熟COCs的表达显著高于未成熟COCs,成熟COCs中EGF基因的相对表达量为未成熟COCs 的2.17±0.36倍,EGFR基因在成熟COCs的表达量为未成熟COCs 6.82±0.21倍,且在未成熟和成熟COCs中EGFR基因表达量均显著高于EGF。免疫荧光检测显示未成熟COCs和成熟COCs均表达EGF和EGFR蛋白,EGF和EGFR蛋白的标记荧光主要集中在卵丘细胞,卵母细胞表达较弱。100 ng·mL^-1 EGF可以显著提高COCs成熟率（73.45±2.09）%及其受精后的卵裂率（59.46±1.41）%和囊胚率（26.23±1.08）%;对照组中（0 EGF）COCs成熟率为(54.16±3.25)%,卵裂率为 (48.33±1.93)%,囊胚率为(15.34±0.43)%;EGF浓度为50 ng·mL^-1时成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(61.79±1.04)%、(51.76±0.61)%和(18.62±1.13)%;200 ng·mL^-1成熟率、卵裂率及囊胚率分别为(71.26±4.18)%、(57.13±2.06 )% 和(23.96±0.53)%;而加入EGFR抑制因子Gefitinib显著的降低了COCs的成熟率及其受精后的卵裂率及囊胚率,分别为(43.63±1.46)%、(41.79±2.81)%和(12.65±0.67)%。COCs成熟过程中EGF的作用可以显著抑制促凋亡基因Bax的表达,在50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1EGF作用后成熟COCs中Bax基因的相对表达量分别仅为对照组（0 EGF）的0.83±0.12,0.21±0.02,0.27±0.03倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Bax基因表达量最低,而Gefitinib作用后可以显著促进成熟COCs中Bax基因的表达,其相对表达量为对照组的4.24±0.10倍;EGF在COCs成熟过程中可以显著促进抗凋亡基因Baxi的表达,其相对表达量在EGF浓度为50、100、200 ng·mL^-1EGF分别为对照组的2.18±0.12、7.06±0.59和6.73±0.31倍,EGF浓度为100 ng·mL^-1时Baxi基因表达量最高,而Gefitinib作用后可以显著降低成熟COCs中Baxi基因的表达,其相对表达量为对照组的0.32±0.04倍。【结论】EGF和EGFR作为牦牛COCs体外成熟过程中重要的自分泌因子,且外源的EGF可以显著提高卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率,最佳作用浓度为100 ng·mL^-1,其作用机制可能与调控凋亡相关基因Bax和Baxi表达有关。     

猪体内与孤雌激活早期胚胎发育特定阶段差异表达基因筛选

 【目的】研究早期胚胎发育基因,筛选猪早期体内发育胚胎和体外孤雌激活胚胎的差异表达基因,探讨影响胚胎发育的分子基础。【方法】分别采用孤雌激活和手术（猪体内发育）的方法收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的胚胎,利用SPEDDRT-PCR挑选不同时期的差异表达产物,将所获得的产物按照片段大小分离纯化后通过反向Northern杂交去除假阳性条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序。【结果】筛选了11个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DDD1-DDD11。经过与GenBank数据进行同源性分析,发现其中DDD3、DDD11没有同源序列信息,提交数据库获得GenBank登录号（EU597224、EU597228）,其余序列发现相似性较高的数据。【结论】对体内正常发育胚胎和孤雌激活胚胎进行对比、分析,发现体内4细胞期和体内8-16细胞期各有1个片段为新基因片段,为进一步分析发育相关基因及其功能奠定基础。     

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下,回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理,同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢,观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精,观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后,未处理组移植体回收率为85.4%,与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段,回收卵母细胞均处在GV期,平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚,2-细胞胚胎发育率为17.5%,未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成,有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体,平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚,其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚,GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%,囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05）,2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01）,处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,但不增加卵母细胞产量。     

GDF-9对牦牛COCs体外成熟培养及其相关基因mRNA表达的影响

为探明生长分化因子-9(Growth differentiation factor 9,GDF-9)对牦牛卵丘-卵母细胞复合体(Cumulusoocyte complexes,COCs)体外培养的卵母细胞成熟率及相关基因mRNA表达水平的影响:采取健康牦牛的卵巢,分离COCs进行体外成熟培养;在牦牛COCs成熟培养液中添加终浓度分别为0、200、400、600ng/mL的GDF-9,统计卵母细胞成熟率;采用Real-time PCR方法检测GDF-9处理的COCs中Smad信号通路下游分子Smad4以及卵丘扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达水平。结果表明:添加0、200、400、600ng/mL GDF-9的COCs成熟率差异不显著(P0.05)。Smad4和卵丘扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达量随着GDF-9浓度升高呈上升趋势,其中600ng/mL GDF-9处理组的Smad4和PTX3mRNA表达量最高,与其他处理组差异显著(P0.05);600ng/mL GDF-9处理组的HAS2、PTGS2mRNA表达量与400ng/mL GDF-9处理组差异不显著(P0.05),与其他实验组差异显著(P0.05)。研究发现,在牦牛COCs体外培养过程中,添加不同浓度的GDF-9对牦牛卵母细胞成熟率的影响差异不显著;GDF-9显著提高其信号通路下游分子Smad4基因以及卵丘细胞扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达,说明600ng/mL GDF-9对牦牛体外培养过程中卵丘扩展有作用,作用机制可能与激活Smad信号通路有关。