利用RAPD技术对满天星试管苗玻璃化发生原因的初步探讨

用200条随机引物对满天星试管正常苗和玻璃苗进行了RAPD分析研究,结果表明:200条随机引物中,有23条引物的扩增产物DNA片段表现出明显的多态性,其中每个引物对不同供试样品扩增出现的DNA谱带数少则5条,多达13条,分布在200～2 000 bp.不同引物扩增出的DNA片段谱带不同,差异较大,选出的23条引物对14个供试样品共扩增出206条DNA谱带,经聚类分析,14个供试样品可分为2类或4类,可直观准确地区分满天星试管正常苗和玻璃苗之间的差异.     

利用5''''锚定PCR技术分离枇杷微卫星标记

用5'锚定PCR技术分离出32个枇杷特异SSR位点,对其中适合设计引物的28个位点设计了相应的引物,并分别与对应的5'锚定的简并SSR引物配对,应用于5个枇杷品种的基因组PCR扩增.结果表明,27条引物在5个受试枇杷品种中有扩增产物,其中24条为可用引物,另外3条引物因为扩增产物不符合SSR标记的特征不能用作SSR标记的引物.     

李种质资源ISSR反应体系引物筛选

以李18个品种种质资源为试验材料,对其开展ISSR反应体系引物筛选,结果表明,从41个随机引物中筛选出25个多态性引物用于PCR扩增,每个多态性引物扩增出的条带数在8～23条之间,扩增出的DNA片段长度大多在150～2 400 bp之间;共扩增出条带数为385条,其中,样品间相同的条带数有53条;所选引物的多态位点百分率为86.23%。     

利用5′锚定PCR技术分离枇杷微卫星标记

用5′锚定PCR技术分离出32个枇杷特异SSR位点,对其中适合设计引物的28个位点设计了相应的引物,并分别与对应的5′锚定的简并SSR引物配对,应用于5个枇杷品种的基因组PCR扩增。结果表明,27条引物在5个受试枇杷品种中有扩增产物,其中24条为可用引物,另外3条引物因为扩增产物不符合SSR标记的特征不能用作SSR标记的引物。     

环介导等温扩增技术的引物设计与筛选研究

[目的]研究引物设计与非特异扩增之间的关系.[方法]以单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的特异性基因hlyA与沙门氏菌（Salmonella）的特异基因invA为例设计引物,进行环介导等温扩增.[结果]就环介导等温扩增的任何2条引物而言,如果2条引物3’端的3～4碱基在同一条引物上都有2个互补序列,在常用的LAMP反应体系与反应条件下,必然有非特异性扩增,LAMP引物设计与筛选应避免这种情况出现.[结论]按照该试验的原则设计引物,可降低非特异性扩增.     

鹧鸪茶种质资源ISSR分子标记中的引物筛选

[目的]为快速和准确地对鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析提供有效引物。[方法]基因组DNA的提取采用改良的CTAB法。利用99个ISSR引物,对来自海南岛境内的10个居群中共20份鹧鸪茶种质材料进行PCR扩增,以筛选出适合于所有鹧鸪茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[结果]从99条供试引物中共筛选出15条多态性丰富、条带清晰且可重复性良好的有效引物。用筛选出的15条引物对66份鹧鸪茶种质材料进行ISSR-PCR扩增,均可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱;共扩增出286条DNA谱带,其中231条为多态性带,占总扩增带数的80.77%,平均每个引物扩增出19.1条谱带。[结论]所筛选的15条引物可以有效地应用于鹧鸪茶种质资源材料的ISSR分析。     

樟科16个树种木材的RAPD与ISSR分子鉴别

采用随机扩增多态性(RAPD)和简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)技术鉴别樟科Lauraceae16个树种。用改良十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠(CTAB-SDS)法提取樟科16个树种192株(12株·种-1)木质部基因组DNA,用RAPD与ISSR技术对它们进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。共筛选出8条RAPD引物与6条ISSR引物,8条RAPD引物共扩增出165条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为153条,多态率为92.7%;6条ISSR引物共扩增出96条大小为100~2 000 bp的条带,其中多态性条带为86条,多态率为89.6%。通过1~2个引物扩增的多态性条带就可鉴别与区分参试的16个树种,为树种鉴定提供技术支持。     

内蒙古绒山羊产绒量和体重性状RAPD标记的初步研究

利用12条随即引物对27只内蒙古绒山羊基因组DNA进行预扩增,筛选出具有多态性扩增产物的4条引物进行RAPD分析,共得到51个标记,其中可变标记43个,标记条带多态性频率为0.84,扩增片断长度在176~2940bp之间。RAPD标记条带与经济性状关系分析表明:CY0816引物扩增产物的ABCFHO组合、F09引物的INR组合为内蒙古绒山羊产绒量的优势组合型;CY0816引物扩增产物的GIJOPQR条带组合为体重性状标记的优势组合型。     

澳洲鸵鸟的随机扩增多态DNA研究

采用随机扩增多态性DNA标记技术对澳洲鸵鸟20个个体进行了遗传变异分析,从60个随机引物中筛选出17个多态性丰富的引物,并对其所有个体的总基因组DNA进行了PCR扩增,结果17条引物共产生103种扩增片段,其中共有片段13条,多态片段90条,平均每条引物的扩增带数为6．06,各引物多态性片段范围在2—9,多态频率在40％-100％。表明澳洲鸵鸟的遗传多样性较丰富。     

三对水稻抗白叶枯病近等基因系的RAPD分析

以水稻抗白叶枯病３对近等基因系为材料，对近等基因系基因组ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析，结果显示；经１２０个１０－核苷酸随机引物对３对近等基因系基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，有２个引物在ＩＲＢＢ３中各扩增出１－２条特异性条带；有３人引物在ＩＲＢＢ４中各扩增出２条特异性条带；有３个引物在ＩＲＢＢ５中各扩增出１－２条特异性条带因轮回中和扩增出２条特异性条带；有３个引物在ＩＲＢＢ５中各扩增出１－２条特异性条带；在     

腐烂茎线虫种内群体特异性检测研究

对腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)7个不同地理群体rDNA 中的ITS区进行PCR-RFLP和序列测定, 发现种内群体间无论在序列长度还是酶切图谱均存在一定的变异.根据其序列特征设计出种特异性引物, 对所供试的腐烂茎线虫群体及属间不同种群体样品的rDNA ITS区相应区段扩增以验证其特异性, 同时对分别由1～5条腐烂茎线虫成虫和幼虫提取的DNA进行特异性扩增以验证其灵敏度. 结果表明: 所有供试的腐烂茎线虫群体均可以特异性扩增一个346 bp的片段, 而所有供试的属外种均没有扩增片段;由1～5条腐烂茎线虫成虫和4～5条幼虫进行的特异性扩增也获得稳定的目的片段. 显示该特异性引物具有较高的稳定性、特异性和灵敏度, 能快速、准确地检测出腐烂茎线虫.     

家兔皮肤真菌通用引物PCR检测和培养鉴定的比较研究

本研究比较了家兔皮肤真菌通用引物PCR检测方法与培养鉴定方法的敏感性,探讨了通用引物PCR检测方法的特异性及其在皮肤真菌诊断中的意义.根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物,对已知分离株及不同微生物进行特异性检测,应用该引物对40份兔患部病料进行PCR检测并克隆测序;同时,采用培养鉴定对40份病料进行表型分析.PCR检测结果显示,家兔四种常见病原性皮肤真菌可扩增出400 ～500 bp之间的条带,其它微生物和兔体细胞均为阴性,说明该方法具有特异性;33份临床病料检测为阳性,扩增条带均为460bp,经测序为须癣毛癣菌.培养法的阳性为26份,检测结果与前者一致.与传统的培养鉴定方法相比,本研究建立的通用引物PCR检测方法,操作简便、特异性高,可用于大规模的家兔皮肤真菌病检测和流行病学调查,并具有重要的公共卫生意义.     

猪繁殖与呼吸综合征病原检测

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M、N基因、伪狂犬病毒和圆环病毒基因序列设计引物,分别应用RT-PCR和PCR方法对上海金山区某养殖猪场疑似为PRRS的送检样品进行检测,结果证实为PRRSV和圆环病毒混合感染。     

天牛干标本DNA的提取及RAPD-PCR扩增反应

对标本馆保存多年的天牛标本进行基因组DNA的提取,并成功用于PAPD-PCR的扩增。结果显示基因组DNA的提取与标本的保存时间无直接的联系,而与标本保存的质量关系密切。用同一引物扩增,不同种天牛的扩增片段呈现多态性。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

中华鳖黄河群体选育世代F_1、F_2及F_3遗传变异微卫星分析

以中华鳖黄河群体的选育基础群体(F0)和太湖群体为对照群体,采用微卫星标记技术对黄河群体的选育世代F1、F2及F3的遗传变异进行了测定和分析。结果表明:(1)从所筛选的10个微卫星位点中,5个测试群体共检测出240个等位基因;平均等位基因数(Na)为4.60～5.30,平均有效等位基因数(Ne)为3.24～3.59,平均观察杂合度(Ho)为0.483 3～0.530 0,平均期望杂合度(He)为0.594 9～0.645 9,平均多态信息含量(CPI)为0.534 0～0.568 4,这些遗传参数表明中华鳖存在丰富的可供选育用的遗传多样性基础。(2)F1、F2及F3选育世代的遗传多样性参数Ho、He及CPI一致地显示出随着选育代数的增加而降低的明显趋势,证明以生长、体色、体型等表型指标为直观选育指标的群体选育,对遗传型指标产生了可检测到的影响。(3)黄河群体的选育基础群体和3个选育世代在聚类分析中聚为一支,而太湖群体单独为一支,显示中华鳖的黄河、太湖两大地理群体间存在较大遗传分化,3代选育并未改变这一历史性格局。     

山羊草及普通小麦遗传多样性的研究

使用微卫星荧光标记-全自动基因分析仪(3700 DNA Analyzer)，用43对D染色体组引物标记76份普通小麦、粗山羊草、拟斯卑尔脱山羊草和尾状山羊草品种和材料，将其结果进行聚类分析，共聚成四类：普通小麦被聚成一类，粗山羊草被聚成两类，拟斯卑尔脱山羊草、尾状山羊草和部分来自巴基斯坦的粗山羊草聚成一类。聚类结果与现有的植物学分类的结果相一致。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列,设计并合成了1对引物,以PRRSV RNA为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增,均获得了分子量为443bp的特异性目的片段,而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92%~98%。敏感性试验表明,该体系可检测到2.39TCID50的PRRSV;对2004~2005年送检的81份临床样品进行检测,阳性率为23.4%。上述研究结果表明,建立的RT-PCR特异性好、敏感性高,可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。