含cry8型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定

为发掘对蛴螬有防治作用的苏云金芽孢杆菌及其cry基因,在河北省各县市共采集土壤样品254份,采用温度筛选法分离出Bt菌株42株,经PCR-RFLP方法鉴定,其中10株含有cry8型基因。这些菌株有如下特点：同一菌株含1种或多种质粒；PCR-RFLP鉴定证明有多种cry8基因存在,多数菌株中含2种cry8基因,如cry8E和cry8F常共存于同一菌株中；Cry8杀虫晶体蛋白分子量约为130~140 kDa,晶体形态均为球形。这10株菌采样地点分布于保定、衡水、邯郸、廊坊、唐山和邢台等地,植被类型多样化,说明cry8型Bt菌株在河北省分布广泛,可为蛴螬类害虫的防治提供丰富的Bt资源。     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

甜高粱汁发酵乙醇的培养基优化

[目的]优化甜高粱汁发酵乙醇的培养基。[方法]以Co-158酵母菌为试验菌株,通过单因素试验和正交试验研究不同氮源和无机盐对酒精发酵的影响。[结果]适宜的发酵培养基为：硫酸铵6g/L,硫酸镁6g/L,氯化钙10g/L,磷酸二氢钾0.3g/L;在此条件下,酒精体积分数可达9.0%。[结论]为采用甜高粱汁为原料发酵法生产酒精提供参考。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌的研究

[目的]利用环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌。[方法]以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）作为靶序列,设计引物,优化Mg2＋浓度、Bst酶浓度等反应条件,建立LAMP反应体系。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的适宜反应条件;该法检测志贺氏菌的灵敏度为62 cfu/ml。[结论]该研究初步建立了一种利用LAMP快速检测志贺氏菌的方法,为食品中志贺氏菌快速检测构建了一个技术平台。     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

定点突变对低温脂肪酶活性和热稳定性的影响

使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对粘质沙雷氏菌菌株L1的脂肪酶(lipA)每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行预测、筛选,用重叠延伸PCR法构建了2个脂肪酶突变体lipA-Asn86Glu、lipAAsn132Lys。经大肠杆菌表达和酶蛋白纯化后,对其酶学特性进行了表征。2个突变体和野生型的脂肪酶最适温度为30℃、最适pH值为8。与野生型相比,lipA-Asn86Glu的比酶活提高了8%,lipA-Asn132Lys的比酶活比野生型降低了19%;lipA-Asn86Glu在50℃下酶的半衰期与野生型相似,Km和Kcat值有所下降,而lipAAsn132Lys的50℃时半衰期、Km和Kcat都明显降低。上述结果为通过理性设计突变位点对酶进行分子改造,以提高酶活力或热稳定性,提供了借鉴和途径。