江苏部分地区猪高热病中猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测

猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因的保守序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为509 bp和372 bp的特异性基因片段,通过优化RT-PCR条件,分别对江苏不同地区送检的21份病死猪的血清、淋巴结、肺、肝、脾、心脏等组织进行单重RT-PCR检测.结果4份CSFV阳性,9份PRRSV阳性,其中3份CSFV和PRRSV同时为阳性.结果表明,CSFV和PRRSV单重RT-PCR诊断方法具有高度特异性,可用于临床诊断.     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp、430 bp和1 015 bp目的片段.以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR.CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性.以β-actin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%.同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒.结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测.     

复合RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟及猪流感等3种病毒方法的建立

为了快速准确地对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流感病毒(SIV)进行诊断与鉴别诊断,特进行试验。根据GenBank上已发表的PRRSV的ORF7基因序列、CSFV的C基因序列和SIV的M基因序列,设计合成了3对特异引物,开展RTPCR检测方法的研究。分别建立了PRRSV、CSFV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,并最终建立了PRRSV、CSFV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,可分别及同时扩增PRRSV 430 bp、CSFV 775 bp和SIV 225 bp的特异性片段。试验证明该方法适用于PRRSV、CSFV和SIV的诊断及鉴别诊断。     

CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

CSFV和PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够同时快速诊断猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)2种传染病的方法,根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核苷酸序列,分别设计并合成2对能特异性扩增CSFV、PRRSV的引物,经过条件优化后,建立了检测CSFV、PRRSV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为508bp和432bp.试验证明,该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,简便、快速、高效,为CSFV与PRRSV的快速诊断及进一步的CSFV与PRRSV的流行病学研究提供了重要的技术支持.     

陕西省PRRSV与CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测

运用RT-PCR和PCR技术对高热病期间陕西西安、宝鸡、渭南、榆林、汉中、商洛等地区猪场送检的146 份样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV) 、猪圆环病毒2 型( PCV2) 和猪伪狂犬病毒(PRV)检测.结果显示:被检样品中PRRSV的阳性率达46.6%(68/146);PRRSV与CSFV、PCV2 和PRV 3种病毒均有混合感染现象, PRRSV + CSFV混合感染率为25%(17/68),PRRSV +PCV2为19.1%(13/68),PRRSV + PRV为4.4% (3/68),PRRSV + PCV2+ CSFV为14.7%(10/68), PRRSV + PCV2+ CSFV+PRV为2.9%(2/68).结果表明以PRRSV为主要病原的混合感染在所检测的高热病发病猪群的存在是非常普遍的.     

RT-PCR和免疫荧光抗体试验检测猪瘟病毒的比较研究

根据已发表的CSFV序列合成1对引物,以猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株为模板,建立并优化了检测CSFV的RT-PCR方法,并与直接荧光抗体试验(DFA)进行比较,检测了15份临床疑似病料。结果如下:应用RT-PCR对CSFV兔化弱毒株RNA进行扩增,获得与预期大小相符长为509 bp的特异性目的片段,敏感性达到10 pg的CSFV-RNA,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪2型圆环病毒(PCV2)进行同条件扩增均为阴性,RT-PCR产物测序结果与文献报道的CSFV不同毒株的核苷酸序列同源性达到95%~99%;15份临床疑似病料应用RT-PCR的检出率为66.7%,而应用免疫荧光试验的检出率为60.0%,二者的总符合率为80%。表明RT-PCR方法比DFA更敏感,两种方法均可用于猪瘟的快速诊断。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR鉴别诊断方法

为了快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合症,参照GeneBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因,设计了1对引物,建立了一种RT-PCR检测方法.该方法可以区分高致病性PRRSV毒株与经典PRRSV弱毒疫苗株,扩增PCV2、PRV、PPV和CSFV等均为阴性.该方法敏感性较高,可以检测到0.2 ng的病毒核酸.     

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。     

多重RT-PCR同时检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV方法的建立及其临床应用

根据猪瘟病毒（CSFV）P120基因及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）Nsp2基因缺失区两端的保守区分别设计合成1对特异性引物,建立了一种简便、快速、同时鉴别检测CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法扩增CSFV基因组时可获得508bp的片段,扩增PRRSV时可获得320bp的片段,扩增HP-PRRSV基因组时可获得230bp的片段,因此,根据多重RT-PCR产物大小可将三者区分开来。利用建立的多重RT-PCR方法,对50份临床可疑病料进行检测,结果发现,CSFV阳性率为8%,PRRSV阳性率为18%,HP-PRRSV阳性率为22%,而CSFV和HP-PRRSV混合感染阳性率达2%,PRRSV和HP-PRRSV混合感染阳性率达16%,说明所建立的多重RT-PCR方法简便、快速、特异,可同时鉴别CSFV、PRRSV及HP-PRRSV,亦可用于感染这3种病毒的临床病料的快速鉴定和分子流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析(英文)

[目的]鉴定由猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭(编号为HN/XT)发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。CSFV和PCV2的鉴定:间接免疫荧光法操作。PRRSV的鉴定:由于PRRSV可致Marc-145细胞发生病变,故可由细胞病变与否作出初步鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

广西部分地区常见猪群疫病感染情况检测

[目的]检测广西猪群主要疫病的感染状况。[方法]2015年,从发病猪场和屠宰场采集猪组织样品276份,应用RT-PCR方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV),并应用PCR方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)。[结果]发病猪场中,CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒感染率分别为3.98%、11.36%、0、28.98%和4.55%,而屠宰场猪CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒的感染率分别为1.00%、2.00%、0、29.00%和3.00%。对猪群混合感染情况分析发现,PCV2和其他病原的混合感染率最高。其中,发病场二重感染率最高的为PRRSV+PCV2,达到5.11%,其次为PCV2+PRV和PRV+PRRS,阳性率均为0.57%。屠宰场二重感染率最高的是PCV2+PRV,阳性率为1.00%。[结论]在发病猪场和屠宰场中,猪圆环病毒2型的感染率最高,且常与其他病原发生混合感染,伪狂犬病毒感染率较2014年有所下降。     

猪瘟病毒与猪流行性乙型脑炎病毒复合RT-PCR检测方法的建立

猪瘟病毒(CSFV)和流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据CSFV的E2基因保守序列和JEV的E基因保守序列,选取 2 对引物建立检测CSFV、JEV的复合RT-PCR方法,分别扩增出了大小为 508 和1 015 bp 特异性基因片段.应用此方法检测了10份临床样品(淋巴结、脾、肝、肺等组织),结果4份CSFV阳性,3份JEV阳性,其余为阴性.结果表明此CSFV 和 JEV 复合RT-PCR 诊断方法,具有很好的特异性和敏感性,可用于临床检测.     

猪繁殖障碍性疫病多重PCR诊断方法的建立及其应用

根据GenBank已发表的猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的序列,经DNAstar生物学软件和BLAST序列分析,利用Oligo6.0软件分别设计并合成了4对特异性扩增引物.在初步优化单项PCR反应退火温度和反应体系的基础上,建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法.结果表明:该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性;对30份临床样品进行检测,结果发现,CSFV、PRRSV、PCV2和PRV的阳性率分别为46.7%、43.3%、53.4%、10.0%,其中,PRV与PCV2、CSFV与PCV2和CSFV与PRRSV混合感染的阳性率分别为6.7%、36.7%和10.0%;PRV、PCV2和PRRSV单一感染的阳性率分别为3.3%、10.0%和33.3%.说明所建立的多重PCR诊断方法,可以应用于CSFV、PRRSV、PCV2和PRV混合感染所引起的猪繁殖障碍性疫病的临床鉴别诊断.     

一步法RT-PCR快速检测猪瘟病毒

对猪瘟病毒(CSFV)5'端非编码区保守序列设计了一对引物,建立了检测CSFV一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对5株CSFV扩增结果均为阳性,对对照毒株扩增结果均为阴性;对CSFV检测的灵敏性为1.09×10-1ng总RNA量。以上结果表明该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

云南省猪场猪呼吸道疾病综合征主要病原调查分析

【目的】猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是引发猪场经济损失的重要原因之一,分析2016—2017年云南省部分地区规模化猪场及散养户间猪呼吸道疾病综合征(PRDC)主要病原的混合感染状况。【方法】通过PCR或RT-PCR对送检病料的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪肺炎支原体(MH)、传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)和副猪嗜血杆菌(HPS) 7种主要病毒性或细菌性病原进行检测。【结果】406份送检样品中,359份为阳性,检出率为88.42%。所检样品中,既有单一携带的,又有混合感染的,PCV2阳性率最高(59.00%);APP阳性率最低(9.09%)。而混合感染以PCV2+PRRSV感染率最高(9.19%),其次为CSFV+PRRSV,感染率为4.46%,PRRSV+PRV和PCV2+MH感染率最低,二者都为0.56%;发现有三重和五重混合感染,以PCV2+CSFV+PRRSV三重感染率最高(2.51%),PCV2+PRRSV+PRV感染率最低(0.28%),CSFV+PRRSV+PCV2+APP+HPS五重感染率为0.28%;未发现四重感染。【结论】PRDC感染情况在云南省广泛存在,且致病病原复杂,所以应加强PRDC感染情况的监测以更有效地防控地方猪疫病发生。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒(SIV)的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法.应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100%.敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。