多重PCR方法快速检测猪的5种呼吸道病原菌

猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、副猪嗜血杆菌(Hps)、支气管败血波氏杆菌(Bb)、产毒性多杀巴氏杆菌(T+Pm)和猪肺炎支原体(Mhp)是最常见的几种猪呼吸道病原菌.笔者参照文献报道的基因序列设计针对App、Hps、Bb、T+Pm和Mhp的特异性引物,对单一PCR条件进行系统优化后建立5重PCR方法.该多重PCR方法能对同一样品中5种病原菌的DNA模板进行扩增,且在5种病原菌之间没有交叉反应;对大肠杆菌等其它6种常见猪细菌性病原的榆测结果均为阴性;对5种病原菌DNA模板检出的最小最均低于160 Pg,且能从攻毒小鼠(App、Hps、Bb和T+Pm)肺脏组织8 h增菌的培养物中快速检测出相应的病原菌.对中国华中地区269份临床样本的检测结果表明,5种呼吸道病原菌在华中地区猪群中普遍存在,且混合感染情况十分严重.这些试验结果表明该多重PCR方法可用于猪呼吸道病原菌App、Hps、Bb、T+Pm和Mhp的单一或混合感染的鉴别诊断及病原流行病学调查.     

伪狂犬病毒中和抗体与gB-ELISA抗体阻断率之间的相关性

为了测定伪狂犬病毒中和抗体与gB抗体之间的相关性,本试验用216份伪狂犬病毒中和抗体阳性血清,对每一份样本作4种不同的稀释(1:1、1:20、1:40、1:80),用Idexx公司的gB-ELISA试剂盒检测.试验结果表明:216份中和抗体阳性血清样品中,有7份gB抗体阴性,阳性检出率为97.8%(209/216);随着中和抗体效价的增高gB-ELISA OD650值降低;gB抗体阻断率随中和抗体效价的增高而增加;对同一份血清样本作1:1、1:20、1:40、1:80稀释,测定结果发现,随着稀释度的增加,gB抗体阻断率逐渐降低,而gB-ELISA OD650值逐渐升高.     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp、430 bp和1 015 bp目的片段.以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR.CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性.以β-actin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%.同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒.结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测.     

三种猪支原体肺炎疫苗在规模化猪场中的临床应用对比试验

正猪肺炎支原体在猪场中的高感染率和普遍流行,引起猪只生长速率减慢和饲料报酬下降而造成的直接损失[1],以及感染后诱发的一系列继发混合感染而产生的死淘率升高所造成的间接损失[2],严重损害了生猪养殖的经济效益。有研究结果表明,猪肺炎支原体主要是通过入侵机体呼吸道黏膜而产生致病作用的[3],因而研发一种能诱发机体呼吸系统产生良好的黏膜免疫保护的疫苗对于预防和控制该病的     

猪喘气病的危害与防控措施

猪支原体肺炎又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎,是一种常被低估的,顽固性、慢性传染病,被认为是最常发生、最广流行、最难净化的原发性疾病.我国该病的发病率在50%左右,而规模化猪场约有90%感染猪肺炎支原体,因而造成重大的经济损失,严重危害着养猪业的发展.因此,正确认识猪支原体肺炎的危害,并且采取有效的防控措施,是提高养猪业经济效益的关键措施之一.     

猪喘气病的危害与防控措施

猪支原体肺炎又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎，是一种常被低估的、顽固性、慢性传染病，被认为是最常发生、最广流行、最难净化的原发性疾病。我国该病的发病率在50％左右，而规模化猪场约有90％感染猪肺炎支原体，因而造成重大的经济损失，严重危害着养猪业的发展。因此，正确认识猪芰原体肺炎的危害，并且采取有效的防控措施，是提高养猪业经济效益的关键措施之一。     

传染性法氏囊病沉淀抗体水平与免疫保护关系的研究

以传染性法氏囊病(IBD)基因工程重组亚单位油乳剂疫苗及其重组活载体疫苗实验室试制品免疫SPF鸡,以法氏囊眼观病变及法氏囊中IBDV抗原检测结果来评定免疫保护效力。结果血清IBDV沉淀抗体水平达到1/8的鸡能抵抗IBDV强毒的攻击,低于1/4的部分鸡不能抵抗IBDV强毒的攻击。经t检验,在以血清IBDV沉淀抗体水平≥1/8所得百分率、血清IBDV沉淀抗体水平≥1/4所得百分率、法氏囊眼观变化正常鸡只百分率及法氏囊中IBDV抗原检测的阴性率之间差异都不显著。表明以血清IBDV沉淀抗体水平≥1/4所得百分率与法氏囊中IBDV抗原检测的阴性率和法氏囊眼观变化正常鸡只百分率一样,适用于评定攻毒免疫保护效力。     

猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答

利用分子克隆、定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,以p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克（M＋PAC）为试验Ⅲ组,PBS＋佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏以及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4。结果显示,Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显著高于Ⅰ、Ⅲ组（P〈0.01）;Ⅱ组IFN-γ水平极显著高于Ⅲ组,而Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-γ水平无显著差异（P〈0.05）;但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的IL-4水平差异不显著（P〈0.05）,但都极显著高于对照组（P〈0.01）;肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4水平呈现一致性,都为Ⅱ组〉Ⅰ组〉Ⅲ组〉对照组;而经刺激脾淋巴细胞检测结果为Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-γ水平最高,而IL-4水平为Ⅲ组最高。由此可见,Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫途径,产生的猪支原体肺炎抗体水平最高;Ⅰ组亦能通过这2种免疫途径达到与Ⅲ组同样的免疫效果。     

规模化猪场母猪群猪瘟抗体水平监测

利用正向间接血凝试验,检测了广西来宾市的5个规模化猪场的864头经产母猪的猪瘟免疫抗体水平。结果表明:在规模化猪场的864份血清中,免疫合格有797份,免疫合格率达92%;其中A场的260份血清中,有248份免疫合格,合格率为95.3%;B场的180份血清中,有162份免疫合格,合格率为90%;C场174份血清中,有157份免疫合格,合格率为90.2%;D场155份血清中,有148份免疫合格,合格率为95.5%;E场95份血清中,有82份免疫合格,合格率为86.3%。80%的猪场都达到90%的免疫合格。     

IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化

采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化.在37℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在37℃和42℃时诱导,分别对诱导时间(5、6、7、8 h)及待选培养基(R1、R2、R3)进行筛选.以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价.结果表明,37℃时诱导,最适宜起始OD600为0.45±0.025,最佳诱导时间为7 h,最佳培养基是R1;42℃时诱导,最适宜起始OD600为0.40±0.025,最佳诱导时间为5 h,最佳培养基是R2.42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时.因此,以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDV VP2基因,在37℃时诱导表达要比42℃时好.