转CP基因的番茄,南瓜和甜瓜植株的抗病性研究

借助土壤农杆菌Ｔｉ质粒介导的叶盘转化法获得了番茄、南瓜三种作物的黄瓜花叶病毒外壳蛋白（ＣＭＶ－ＣＰ）基因工程植株。比较了三种转化植株对ＣＭＶ的抗病性类型。试验结果：番茄转化植株表现为免疫反应，南瓜为抗扩散反应，而甜瓜主要表现为早期抗性，即明显推迟接种植株的发病。用二个不同血清型的ＣＭＶ株系接种三种作物的转化植株，同一种转化植株对不同株系的抗性反应一致。三种转化作物中表达了ＣＭＶ－ＣＰ基因的植株均能     

马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建

本研究报道马铃薯Ｙ病毒普通株系外壳蛋白基因ｃＤＮＡ克隆,全序列分析及其原核表达载体构建的结果。从感染ＰＶＹ的烟草叶片中提取病毒粒体,ＳＤＳ－酚法提取病毒核酸。以所提核酸为模板,用一对ＰＶＰＣＰ基因引物进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增了０．８０ｋｂ的特异性核苷酸片段。该片段大小五国外报道的ＰＶＹ ＣＰ基因一致,将ＰＤＲ产物插入到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中转化大肠杆菌ＤＨ５α。     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

抗真菌鲎素基因在大肠杆菌中的表达

人工设计并合成了抗真菌多肽鲎素基因,将合成的鲎素基因首先克隆到了ｐＵＣ１８载体上,利用通用引物测序,获得了与预期碱基序列完全一致的目的基因。再将鲎素基因克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１上,诱导表达融合蛋白。经ＩＰＴＧ诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测,在２９ｋＤ处出现了ＧＳＴ－鲎素融合蛋白条带,与预期分子量大小相     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

从狂犬病病毒感染的ＢＨＫ细胞裂解上清液中快速提取病毒ＲＮＡ,用反转录－聚合式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到编码核蛋白完整结构基因的ｃＤＮＡ,进一步将此基因克隆入ｐＵＣ１８中,进行核苷酸序列分析,并与国外ＰＶ、ＣＶＳ、ＳＡＤＢ１９株以及国内５ａＧ株的Ｎ基因序列进行了同源性比较,证明所克隆Ｎ基因正确。     

玉米转座因子Ac在转基因烟草及其后代中的转座行为

用带嵌合基因３５Ｓ－Ａｃ－ＧＵＳ的农杆菌双元载体转化普通烟草品种Ｎｃ８９,对转基因植株及其回交后代,进行ＧＵＳ组织化学分析,检测到转座因子Ａｃ在部分Ｔ０代和ＢＣＦ１代植株中转座。用Ａｃ作探针,与上述Ｔ０代和ＢＣＦ１代植株的基因组ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,结果表明,Ａｃ从原来所在的Ｔ－ＤＮＡ解离,并整合到烟草基因组的其它位点。     

马铃薯Y病毒HC-Pro基因的克隆、序列分析以及原核表达

本研究以马铃薯Ｙ病毒中国株系（ＰＶＹ－Ｃ） ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆了ＰＶＹ－Ｃ ＨＣ－Ｐｒｏ基因,并对其进行了序列分析,测序结果表明ＰＶＹ－ＣＨＣ－Ｐｒｏ基因全长为１３６８ｎｔ,编码一个含４５６个氨基酸的蛋白。它与ＰＶＹ其它株系的同源性高于与马铃薯Ｙ病毒属其它种病毒的同源性,与所报道的ＰＶＹｎ株系的碱基及氨基酸序列同源性均为９６％,推测ＰＶＹ－Ｃ可能是ＰＶＹｎ株系或它的一个近缘株系。Ｓ     

小麦品种复壮30抗白粉病基因RAPD标记的研究

冬小麦品种复壮３０中具有一对抗白粉病隐性基因,该基因对我国流行的白粉病生理小种表现为高抗或免疫,虽尚未定名,却已受到国内外的重视。我们分别以复壮３０、感病品种农大０１５、京花一号的ＤＮＡ为模板,采用３００个ＲＡＰＤ引物（ＵＢＣ４００－ＵＢＣ６９９）进行ＰＣＲ扩增,其中ＵＢＣ４０５（ＣＴＣ ＴＣＧ ＴＧＣ Ｇ）可在抗、感品种之间扩增出一多态性片段（６２８ｂｐ）,定名为ＵＢＣ４０５－６２８。通过对Ｆ２     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及其重组鸡痘病毒转移载…

根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列设计并合成一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２ｃＤＮＡ的引物，以纯化的ＩＢＤＶ－Ｄ７８弱毒疫苗株基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出约１．５ｋｂ产物。将ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点，经酶切图谱分析等方法鉴定出重组ＶＰ２ｃＤＮＡ质粒（ｐＶＰ２）。将ＶＰ２基因正向插入ＦＰＶ启动子ＬＰ２３Ｐ２下游，连同痘苗病毒启动子Ｐ１１启动的ＬａｃＺ报告基因盒插入ＦＰＶ转移载体中     

酿酒酵母耐铜基因CUP1的克隆及其植物表达载体的构建

酿酒酵母铜金属硫蛋白（ｃｏｐｐｅｒ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,Ｃｕ－ＭＴ）,属于第Ⅱ型金属硫蛋白,Ｃｕ－ＭＴ由酿酒酵母耐铜基因ＣＵＰ１编码,由６１个氨基酸残基组成,其中半胱氨酸残基１３个,占Ｃｕ－ＭＴ总氨基酸数的２１．３％,Ｃｕ－ＭＴ与铜离子有较强的结合力,在酵母细胞中主要参与过量铜的解毒作用。本研究通过ＰＣＲ方法,从酵母基因组ＤＮＡ中扩增出了ＣＵＰ１基因,克隆于ｐＵＣ１９的多克隆拉点。扩增     

我国花生矮化病毒（PSV）株系的血清学和壳蛋白基因序列分析

琼脂双扩散血清试验表明，参试的我国花生矮化病毒６个分离物和株系之间血清学关系十分亲近，而与美国ＰＳＶ－Ｅ和ＰＳＶ－Ｗ株系存在明显的差异。完成对花生致病力不同的ＰＳＶ－Ｍｉ和ＰＳＶ－Ｓ两个株系壳蛋白基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增，克隆和序列分析。     

水稻醇溶蛋白4a基因启动子在转基因水稻中的特异性表达

利用ＰＣＲ方法从水稻“中花８号”基因组中扩增出醇溶蛋白４ａ基因启动子后,将其与ＧＵＳ基因融合,通过基因枪法导入水稻“台北３０９”中。对转基因水稻植株进行的组织化学分析表明,ＧＵＳ基因特异性在种子的胚乳中表达,而在其它的组织中没有表达。水稻醇溶蛋白基因４ａ启动子的胚乳特异性表达可以稳定遗传到下一代。     

生长因子对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨生长因子（ＥＧＦ，ＰＤＧＦ）对牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响，本研究进行了两个实验。实验１：在卵母细胞体外成熟（ＩＶＭ）中，将卵母细胞平均随机的放入表皮生长因子浓度为０，２．５，２５，５０μｇ／Ｌ的成熟培养液和对照组中。实验２：在早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）过程中，将受精卵平均随机分配入５个不同培养液的处理组：（１）ＴＣＭ－１９９＋１０％阉公牛血清（ＳＳ）；（２）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ＋ＰＤＧＦ；（３）ＴＣＭ－１９９＋ＥＧＦ；（４）ＴＣＭ－１９９＋ＰＤＧＦ；（５）ＴＣＭ－１９９＋无生长因子、其中ＥＧＦ：５０μｇ／Ｌ，ＰＤＧＦ：０．１μｇ／Ｌ。２，３，４，５组有０．１％ＰＶＡ和０．３％ＢＳＡ，并与颗粒细胞单层协同培养。卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）和早期胚胎体外培养（ＩＶＣ）的方法与Ｌｕ等（１９８７）报道的相同。结果表明：浓度为５０μｇ／Ｌ的处理组分裂率与对照组无差异（８９．０％，９２．４％，Ｐ＞０．０５），而浓度为０，２．５，２５μｇ／Ｌ的处理组分裂率均显著低于对照组（７８．６％，８２．３％，８４．３％，Ｐ＜０．０５），在囊胚率和第７ｄ一级胚胎率上各组均无差异。ＥＧＦ在体     

植物病毒复制酶基因介导的抗病性研究进展（综述）

用编码病毒复制酶的基因转化植物能赋予植物对病毒的高度抗病性。利用病毒的复制酶基因已经成功地获得对烟草花叶病毒（ＴＭＶ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）、马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）等具有高度抗病性的转基因植物。复制酶基因在ＲＮＡ水平或者蛋白质水平上的表达，干扰了复制酶的正常功能，进而有效地抑制了病毒的复制，从而达到抗病的目的。     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2重组鸡痘病毒的构建

含ＩＢＤＶ保护性抗原ＶＰ２的质粒,以ＳｐｈＩ消化,然后用Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶将末端补平,产物纯化后再以ＳａｌＩ消化一次,经再次纯化后与ＳｍａＩ和ＳａｌＩ分步酶切的鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１相连,使唤基因顺向插入到载体Ｐ７５启动子下游,得到含ＩＢＤ ＶＰ２基因的重组插入载体ｐＦＧ ＶＰ２。     

番茄中反义ACC合成酶基因的导入与乙烯生物合成的控制

利用农杆菌ＬＢＡ４４０４携带反义ＡＣＣ合成酶基因和卡那霉素抗性基因，采用叶盘法转化番茄栽培品种“丽春”子叶，通过组织培养获得了能在卡那霉素培养基上生长的再生植株并进一步培养获得了延缓成熟和衰老的番茄果实。经过ＤＮＡ杂交和ＲＮＡ杂交检测，证明反义ＡＣＣ合成酶基因已插入番茄基因组中，并顺利地表达。     

花生条纹病毒外壳蛋白基因cDNA的合成、克隆及全序列测定

自田间采集的花生病叶中提取花生条纺病毒（ＰＳｔＶ）总ＲＮＡ,人工合成引物Ｐ１、Ｐ２,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成ＰＳｔＶ－ｃｐ的ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定,结果表明：该布１０８４个核苷酸组成,包含了ＰＳｔＶ－ｃｐ ｃＤＮＡ完整的８６１ｂｐ编码序列（编码２８７个氮基酸）以及３＇端２２３ｂｐ非编码序列,与文献报道的４个ＰＳｔＶ－ｃｐ基因具有较高的保守性。     

不带抗药性基因的nifA质粒的构建

本研究克隆了萤光假单胞菌ＡＳ１．５５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＳ１．５５）的亮氨酸基因（ｌｅｕ＾＋）ＥｃｏＲＩ片段（－６．６ｋｂ）,并获得含有该片段的重组质粒ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ。从ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ质粒中分离出ｌｅｕ＾＋ＥｃｏＲＩ片段,将其插入到ｎｉｆＡ质ｐＭＣ７１Ａ的ＥｃｏＲⅠ位点使氯霉素抗性基因失活,从而构建了不带抗药性基因ｎｉｆＡ质粒ｐＭＣ７１Ａ－ＬＥＵ。     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的序列分析

用根据国外已报道的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）的ＲＮＡ２的序列合成的两个引物，通过对ＢＮＹＶＶ新疆分离物的ＲＮＡ逆转录获得了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白基因的ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后用Ｔ４聚合酶补平两端，克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒的ＳｍａＩ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经筛选得到正向插入的重组质粒ｐＧＥＢ３。用ＰＣＲ扩增和酶切均得到５９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＡＢＩ３７０Ａ型ＤＮＡ全自动序列仪测出该ｃ     

人的β干扰素基因在烟草中整合及表达

本研究把含有β干扰素基因的植物表达载体ｐＧ２１（含有β干扰素基因的信号肽）和ｐＧ１１通过三亲结合转移到了农杆菌Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ２２６０）中，并与ｐＧＶ２２０６０发生同源重组而稳定存在于它Ｔｉ质粒ｐＧＶ２２６０上，进一步用此载体把β干扰素工因转移到了烟草细胞中Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析证明了此基因已整合到染色体上，ＲＮＡ点杂交及ＮＰＴⅡ酶分析显示此基因植物细胞中得到了表达，实验中还发现含有ｐＧ２１的农杆