乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的克隆及在番茄果实中的表达

摘要：为研究野生型番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv . Lichun）和转反义ACS 番茄果实中乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern 杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。     

转基因（反义ACS和反义Nr）番茄伤流中植物激素的运输＊

以转反义ACS（ACC合成酶）和反义NR（乙烯受体蛋白）基因番茄和普通番茄（Lycopersicon escclentum Mill．）作为试材，通过ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）方法研究了抑制乙烯合成的外源基因转入番茄后，伤流中植物激素的变化。发现转基因番茄和普通番茄在盛花期和盛果期伤流中各种植物激素的含量变化不显著；而到了成熟期伤流中IAA、GA，和CTKs（细胞分裂素）仍然没有显著变化，但转基因番茄伤流中ABA含量与普通番茄相比却显著减少，说明ABA和乙烯对番茄成熟衰老的控制是共同起作用的，乙烯释放量的改变和信号转导途径的抑制都会影响ABA的伤流运输。     

乙烯受体基因LeFTR1和LeFTR4的克隆及在番茄果实中的表达

为研究野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill．cv．Lichun)和转反义ACS番茄果实中乙烯受体基因上eETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。     

固氮粪产碱菌基因文库的构建及ntrC的克隆

采用广泛寄主范围的粘粒载体ｐＬＡ２９１７构建粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ的基因文库。以巴西固氮螺科菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｎｔｒＣ ＤＮＡ为探针，经菌落杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选获得含ｎｔｒＣ－ｌｉｋｅ基因的阳性克隆ｐＬＡＦ５８，建立了含ｎｔｒＣ同源序列的９．５ｋｂ ＳａｃＩ片段的物理图谱，采用巴西固氮螺菌ｎｔｒＢ ＤＮＡ探针杂交证明粪产碱菌ｎｔｒ     

反义PEP基因调控油菜籽粒蛋白质/油脂含量比率的研究

利用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０１携带反义ＰＥＰ基因和卡那霉素,潮霉素抗性基因,采用共培养法转化甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）浙油７５８和浙优油１号的下胚轴,通过组织培养获得了能在培养基上生长的油菜转基因植株。经ＧＵＳ组织化学染色及ＰＣＲ扩增检测,证明外源基因已插入油菜基因组并得到表达。浙油７５８转基因植株Ｔ１代种子平均含油量比对照提６．     

甘露糖阳性选择系统的建立及在番茄转化中的应用

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶基因（pmi)并进行了序列测定。将该基因替换植物表达载体pAMBIA2301中的卡那霉素抗性基因，构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI，并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究了甘露糖对番茄(Lycopersicum esculentum)生长和生根的影响及叶盘对甘露糖的敏感性。通过根癌农杆菌介导对番茄进行遗传转化，获得转化番茄再生植株，并对转化植株进行了PCR扩增检测。研究表明以甘露糖阳性选择系统在番茄遗传转化中应用是可行的。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯产量的抑制

筛选番茄幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11，设计引物，利用RT-PCR方法从受到病原浸染的番茄叶片中获得长1018 bp的候选片段，同源性分析发现该片段与其他作物上已发表的ACO基因序列高度同源：同源率从83%~99%，推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上，用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉（RNAi）载体pD311，对番茄进行遗传转化，获得卡那霉素抗性植株27棵，分子检测证实外源片段成功导入其中番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明，RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达，从而导致乙烯的生成大大降低。     

水稻白叶枯病黄单胞菌赖氨酰－tRNA合成酶基因的定位、克隆及分析

以３２Ｐ标记的甘蓝黑腐病黄单胞菌赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因为探针，将水稻白叶枯病黄单胞菌同功的基因定位于ｐＧＸＮ３０００１．６ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段上．通过ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，标记置换等方法初步证实：在稻白叶枯病黄单胞菌中只有一个拷贝的赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因，该基因失活对病菌是致死的。     

含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达的研究

将携带有乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢｓＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２）基因的植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ，分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中，通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证明现任中外源基因已插入到植物染色体中。ＥＬＩＳＡ检测结果表明用ＨＢｓＡｇ基因转化的番茄叶片和果实中都能表达ＨＢｓＡｇ，而用含ｐｒｅＳ的ＨＢｓＡｇ基     

反义乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因对草莓的转化

通过根癌农杆菌EHA105将含有反义FaEtr1和FaErs1基因的双价植物表达载体pFRS导入草莓，经卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养并经PCR和Southern blot检测证明，其中15株的基因组已成功导入和整合反义FaEtr1和FaErs1基因。Northern分析表明，转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。     

番茄SlPSY1基因转录调控因子筛选及互作验证

番茄八氢番茄红素合成酶(SlPSY1)作为类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶,直接影响果实中类胡萝卜素的积累。为探究SlPSY1基因的转录调控机制,通过克隆SlPSY1基因启动子序列,构建pSlPSY1pro-AbAi诱饵载体,并将诱饵载体转化至酵母细胞中获得诱饵酵母菌株。利用番茄混合组织酵母杂交cDNA文库进行酵母单杂交筛库试验,筛选得到AP2/ERF家族转录因子SlJERF1和10个未知功能蛋白。后续克隆SlJERF1基因序列,构建pGADT7-SlJERF1重组载体,通过酵母单杂交点对点对SlJERF1进行分子验证,结果显示在金担子素(AbA)浓度为150 ng·mL^-1的条件下,对照组酵母不能正常生长,而试验组酵母能正常生长,表明SlJERF1与SlPSY1基因启动子存在互作。这一结果为进一步拓展类胡萝卜素合成调控网络提供了重要的理论依据。     

番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯释放的抑制

筛选番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11,设计引物,利用RT-PCR方法从受到病原侵染的番茄叶片中获得长1018bp的候选片段,同源性分析发现该片段与其它作物上发表的ACO基因序列高度同源,同源率83%～99%,推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上,用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉(RNAi)载体pD311,对番茄进行遗传转化,获得卡那霉素抗性植株27棵,分子检测证实外源片段成功导入番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明,RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达,从而导致乙烯的生成大大降低。     

油菜(B.napus)属种间杂种后代的遗传研究

本研究通过油菜与萝卜属间杂种（ＡＣＲ）为亲本材料,分别与芸苔Ｂｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ和甘蓝Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ杂交,属种间杂种（ＡＡＣＲ,ＡＣＣＲ）再与甘蓝型油菜品种杂交,以获得稳定的转基因属种间杂种材料。结果指出,属间杂种与芸苔Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ杂交比与及甘蓝Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ杂交更易获得后代。这些杂种后代分别与甘蓝型油菜回交也表现了这种趋势。细胞学分析指出,属种间杂交由于异源染体的存在     

Frankia共生固氮基因的分离与克隆

利用ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交方法，分离细枝木麻黄的Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ｃｏ０１的ｎｉｆ克隆ｐＣｃ１ＧＸ，赤杨内生菌株Ａｔ４的ｎｉｆ克隆ｐＡｔ１ＧＸ及沙棘的ＦｒａｎｋｉａＨｒ１８的ｎｉｆ克隆ｐＨｒ１８ＧＸ、ｐＨｒ１１－③ＧＸ。用基因功能互补法，从Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的基因文库中分离到二个可能可互补豌豆根瘤菌ｎｏｄ基因功能的克隆ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ，并制作了ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ的亚克隆，予进一步实验，获得充分的证据证明ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ是否带有Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的ｎｏｄ基因．     

桃叶片伤诱导ACC氧化酶基因cDNA的克隆,序列分析其在大肠杆？…

以桃ＡＣＣ氧化酶基因和ＤＮＡ为探针,与伤处理诱导后桃叶片总ＲＮＡ进行点杂交,结果表明,未经伤处理的样品示能检测杂杂交信号,伤处理后２－４ｈ左右信号达到最强,将其样品ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,通过反转录聚合酶链式反应得到一条０．９５ｋｂ的特异性扩增产物,该扩增产物能与桃ＡＣＣ氧化酶基因组探针杂交。     

啤酒糖酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶编码基因tps1的cDNA克隆

本工作从抗逆性极强的啤酒糖酵母菌株 Ａ Ｓ２１４１６ 中分离纯化总 Ｒ Ｎ Ａ 和 ｍ Ｒ Ｎ Ａ ,以 Ａ Ｍ Ｖ 逆转录酶合成了单链ｃ Ｄ Ｎ Ａ 。采用保守引物扩增并克隆了该酵母菌的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因ｔｐｓ１ ,建立了该基因 Ｄ Ｎ Ａ 片段的物理图谱,发现其酶切位点与已见报道的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因相同。     

含与不含前导序列的乙肝病毒表面抗原在转基因番茄中表达？…

将携带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和ＨＢｓＡｇ及其前导序列基因的植物表达载体ｐＲＯｋⅡ,分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中,通过叶盘转化法得到转基因番茄及其后代。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证明两种外源基因已插入到植物染色体中。     

可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因对马铃薯的遗传转化

马铃薯是淀粉生产中重要的农作物之一,而可溶性淀粉合成酶SSⅢ是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分,通过基因工程的手段来研究SSⅢ基因在淀粉合成中的功能可以用于改良马铃薯淀粉的品质。本研究采用根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV35S驱动的可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的RNA干扰表达载体导入马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得了65株卡那霉素抗性植株。对抗性植株PCR检测结果表明,SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中,RT-PCR检测表明SSⅢ基因在转录水平上受到了明显抑制。该研究为马铃薯淀粉品质的改良奠定了基础。     

定性PCR技术及卡那霉素对8个番茄品种的转基因检测

本研究利用定性PCR技术对8个不同番茄品种中外源基因35S启动子、NPTⅡ基因和NOS终止子进行检测。实验结果表明,阳性对照可以稳定扩增到预期的大小片段,而待检测品种和阴性对照则没有扩增到预期产物。利用100mg／L的卡那霉素对8个不同番茄品种的种子进行萌发试验,再用50mg／L的卡那霉素对番茄外植体（子叶和下胚轴）进行抗性验证,结果显示卡那霉素抗性筛选实验结果与定性PCR结果一致。本文通过对这两种检测方法的优缺点进行研究分析及比较,初步建立了一个对不同品种番茄进行转基因检测的体系。     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）exoC基因的克隆及其特性

应用Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｓｐ７的ｅｘｏＣ基因为探针，发现Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１具有与Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｅｘｏＣ基因同源的基因。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｅｘｏＣ基因能恢复Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＥＰＳ缺陷型（ＥＰＳ＾－）突变，表明粪产碱菌ＥＰＳ的产量为ｅｘｏＣ基因产物所调控。本工作已获得类似Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７的ｅｘｏＣ－ｌｉｋｅ基因的克隆