PMI基因为选择标记植物表达载体的构建及在雪柑转基因中的应用

以PMI基因替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因以及pBI121中的GUS基因，构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301PMI和pBIPMI，并导入根癌农杆菌EHA105中。研究了两种表达载体对雪柑上胚轴的转化，在培养基附加25 g•L-1甘露糖和5 g•L-1蔗糖为碳源的选择压下，pCAMBIA1301PMI的转化率为27.7％，pBIPMI的转化率为12.7％，对再生植株进行了氯酚红检测和PCR检测，建立了以PMI/甘露糖为选择系统的雪柑转基因体系。     

PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及其在雪柑转基因中的应用

以大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因以及pBI121中的gus基因,构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301PMI和pBIPMI,并导人根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中.研究了两种表达载体对雪柑(Citrus sinensis L.Osbeck)上胚轴的转化,在培养基附加25 g/L甘露糖和5 g/L蔗糖为碳源的选择压力下,pCAMBIA1301PMI的转化率为27.7%,pBIPMI转化率为12.7%,对再生植株用氯酚红和PCR检测证实了PMI基因的导入,建立了以PMI/甘露糖为选择系统的雪柑转基因体系.     

乙肝表面抗原基因表达载体的构建及对百脉根的转化

利用PCR成功的从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因,并构建了含有此基因的植物表达载体pBHB。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法将乙肝表面抗原基因转入百脉根(Lotus corniculatus),从转化植株中提取DNA做PCR检测、Southern杂交,阳性结果验证了目的基因已整合到百脉根的基因组中,转化效率为20%,证实转化的载体真实高效。     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

反义乙烯受体LeFTR2基因对番茄的转化和功能分析

采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将LeETR2的部分反义序列导入番茄(Lycopersicon esculentum)子叶外植体，经抗性筛选和组织培养获得再生植株。通过对转基因植株中插入序列的PCR检测和Southern杂交，证明转化番茄成功。通过对LeETR2的功能的初步研究结果表明，转基因植株顶端优势丧失、极端矮化和番茄果实的内源乙烯合成量增加。这提示此基因在植物乙烯信号感受与转导系统中起着负调控的作用。     

芪合酶基因转化小白菜的研究*

利用质粒pBin438构建了含有NPT Ⅱ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)品种中，经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测，RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达，共获得了7株转基因植株。     

花青素调节基因Lc对转基因烟草和矮牵牛花色的影响

利用PCR的方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355，将XY355与玉米花青素调节基因Lc融合构建植物表达载体pXY60。用冻融法将pXY60转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后以烟草（Nicotiana tabaccum L.）和矮牵牛（Petunia hybrida）的叶盘为外植体，通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化。对再生植株的PCR检测证明外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。对转基因烟草和矮牵牛的表型进行观察：转Lc基因烟草的花色由浅红变成了红色，转Lc基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。     

芪合酶基因转化小白菜

利用质粒pBin438构建了含有NPTⅡ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)品种中,经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测,RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达,共获得了7株转基因植株。     

根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系的建立

以建立的苜蓿高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法，研究了影响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens Conn)LBA4404菌株介导的苜蓿（Medicago sativa L)遗传转化的若干因素，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系，获得了转BADH基因植株。苜蓿的不同基因型、附加乙酰丁香酮的浓度、预培养与否、菌液浓度、共培养时间和卡那霉素浓度等对转化频率都有一定影响。最高转化频率可达43.3％，抗性植株经PCR和PCR-Southern blot检测表明，目的基因已整合进苜蓿基因组中。