农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列（Sac Ⅰ-EcoR Ⅰ）通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加，即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有4个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白（GFP）对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带GFP的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体（pBI121-GZ）构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因马铃薯的抗旱耐盐性

通过根癌农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入马铃薯栽培品种甘农薯2号, 经PCR、Southern杂交和Northern杂交证明BADH基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定表明对照植株没有BADH酶活性, 各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似, 在2~11 U之间。BADH酶活性与叶片的相对电导率呈一定的负相关(y= –3.7738x+57.083, r=0.989^**)。在NaCl和PEG胁迫下, 转基因植株生长正常, 株高比对照提高0.41~1.00 cm, 单株重量比对照增加10%~35%, 说明外源BADH基因的导入提高了马铃薯植株对干旱和盐碱的抗性。     

马铃薯原生质体游离与培养体系的研究

普通马铃薯四倍体栽培种“甘农薯2号”、“Favorita敗ⅰ癛usset Burbank”试管苗叶片为材料来源,游离培养马铃薯原生质体。结果表明,游离前材料的低温预处理,酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理,均能显著提高原生质体产量。用Ficoll密度梯度离心法收集原生质体进行培养,结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果。培养液中加入10 %～15 % 的马铃薯提取液并进行愈伤组织看护培养,有良好的培养效果。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

奈乙酸、2,4-D对马铃薯愈伤组织细胞染色体倍性的影响

以３种不同基因型的马铃薯试管苗茎段做材料，用奈乙酸（ＮＡＡ）和２，４ Ｄ的不同浓度进行愈伤组织的诱导并观察染色体的变异情况，试验表明：在同一浓度下２，４ Ｄ诱导愈伤组织的能力优于ＮＡＡ；且在愈伤组织生长过程中，２，４ Ｄ导致导致细胞染色体加倍的能力也明显强于ＮＡＡ；随２，４ Ｄ和ＮＡＡ浓度的增高，细胞染色体的加倍率明显提高，且细胞染色体的混倍现象也逐渐增高。不同的激素及不同激素浓度对愈伤组织的诱导率和细胞加倍率不同；随生长素浓度的增高，染色体的加倍率明显提高且细胞染色体的混倍现象也逐渐增高。     

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的调控

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成过程中一个限速酶 ,其表达受到转录、温度、底物等多种因素调控。在 2 5℃其活性最强。 3 磷酸甘油和焦磷酸分别是其最有效的激活剂和抑制剂 ,其它物质如BSA、半胱氨酸、 2 巯基乙醇和谷胱甘肽都能使腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性有所提高 ;NADP +、ADP、AMP等轻微地抑制腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性。     

马铃薯sgt2基因启动子的克隆及其活性分析

糖苷生物碱(SGAs)是一类存在于茄科和百合科植物的重要次生代谢物,与植物的抗逆性和产品品质有密切关系.茄啶葡糖基转移酶(SGT2)是SGAs合成代谢途径的末端关键酶之一,研究其编码基因的启动子序列对于SGAs生物合成代谢调控有重要的作用和意义.本研究采用染色体步移技术,克隆到马铃薯茄啶葡糖基转移酶基因(sgt2)起始密码子上游2 098bp的启动子序列,已注册到GenBank(注册号:KC331038).构建该启动子驱动报告基因gfp∶∶gus的植物双元表达载体p1304sgt2p,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达,通过GUS组织化学染色分析sgt2p启动子的活性.结果表明:gus基因在转化烟草叶片中高效表达,克隆的启动子具有活性.     

振动挖掘铲减阻数值模拟及参数优化

对小型振筛式马铃薯挖掘机振动挖掘铲的性能参数进行优化,借助Adams和Ls-Dyna相结合法模拟振动挖掘铲挖削土壤过程,据4因素3水平响应曲面法试验设计原理对影响挖掘铲挖削阻力的因素进行了多因素方差分析,并建立和优化了回归模型。结果表明:影响牵引阻力的因素由大到小依次为振动频率、牵引速率、入土角、振幅;当牵引速率为0.67m/s、振动频率13.77Hz、振动幅值11.93mm、入土角8.35°时,优化牵引阻力为1 449.59N。田间验证试验结果表明:试验阻力平均值与仿真结果误差5%,说明回归模型能较好的反映振动频率、牵引速率、入土角、振幅于牵引阻力之间的关系。