柞蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆与分析

以柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)DNA为模板,运用PCR技术钓取ApNPV(IE-1)基因的启动子片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序分析.将测序的2.7 kb DNA片段用EcoR I和Bgl II双酶切,回收3＇端1.6 kb的DNA片段.将该片段插入到pGFP-N2表达载体上构建以其作为启动子的IE-1/pGFP-N2重组质粒.重组质粒经脂质体介导转染Hela细胞,结果可见绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达,证明钓取的IE-1基因启动子片段具有启动子的转录活性.     

拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子的克隆与序列分析

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99．8％。     

水稻 Glu B-1启动子克隆及序列分析

GluB_1是水稻种子谷蛋白的编码基因,是种子成熟过程中,由GluB_1启动子调控,特异地在胚乳中表达的蛋白。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到Glu B_1启动子片段,将其克隆在pGEM_T Easy载体上进行序列分析。结果表明:获得的启动子片段的大小为2 293 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.2%。该启动子区域含有ACGT基序、AACA基序和GCN4基序等胚乳特异表达必需元件。     

水稻谷蛋白GluB-4基因启动子克隆及载体构建

GluB-4是水稻种子谷蛋白的编码基因,在种子成熟过程中,由GluB-4启动子调控,在胚乳中特异地表达。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到GluB-4启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为1 560 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.8%。该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Skn-1基序等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件,同时还含有高水平转录调控因子5UTR Py-rich stretch序列。利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pCGB4P,为进一步的研究工作奠定了基础。     

ACS基因和HBsAg基因的克隆及瞬时表达分析

本研究通过SDS法从香蕉幼嫩叶片中提取基因组DNA,通过PCR的方法对ACS启动子2.5Kb的序列进行缺失改造,克隆到了长1 185bp的ACS启动子片段,与GenBank报道序列相比较同源性为93.2%.经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件,经预测ACS启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导.为验证其果实特异表达活性,通过插入到pBI 101.2中间表达载体上的GUS基因5＇端前,构建了含GUS基因的瞬时表达载体pBACS.用基因枪法将pBACS转化到香蕉果实中,结果表明：用pBACS包被的金粉轰击的果实经GUS组织化学染色后,都出现兰色斑点,对照没有出现兰色斑点.因此认为GUS基因在香蕉果实成功实现瞬时表达.同时,通过改进的酚-氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取总DNA,然后根据报道的序列设计特异性引物,同时在上游引物中引入了Kozak序列,经PCR克隆到HBsAg基因序列,长度为681bp.NCBI BLAST分析的结果表明,获得的HBsAg基因序列及推导的氨基酸序列与GenBank中所报道的序列的同源率分别为97.2%和97.4%.将经过改造的HBsAg基因替代pBACS中的GUS基因,成功构建了含有ACS启动子和HBsAg基因的香蕉树果实表达载体,为下一步转化香蕉,获得在果实中表达HBsAg蛋白的转基因植株奠定了基础.     

拟南芥菜花药绒毡层启动子的克隆和序列分析

以拟南芥菜(Arabid　op　sis thaliana)基因组DNA为模板 , 通过PCR扩增得到绒毡层特异 表达基因A9的启动子片段, 克隆到pUC18载体上。 序列分析表明, 该启动子大小为36 0 bp , RNA聚合酶识别序列TATA box, 花药特异表达和增强序列TGTGG、 TGTGA两个Motifs皆完整 , 与已报道的序列比较仅有3个核苷酸发生改变, 同源性为99.     

玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明,该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明,在小麦幼胚愈伤组织中,玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低,但经纹枯病菌诱导后,ZmPR4启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性,能够驱动GUS基因的表达。因此,玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

玉米ZmPR4启子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析

以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达

以水稻品种"明恢63"基因组DNA为模板, 用PCR方法克隆出水稻蔗糖合酶基因起始密码子以前(包括第一内含子)的上游序列RSP1及其不包括第一内含子的上游调控序列RSP2. 测序结果显示, 在重要的功能区段上, 克隆的序列与Wang(1992)等的报道基本一致. 构建了由RSP1和RSP2驱动报告基因Gus的植物表达载体, 并用于农杆菌介导法水稻遗传     

INO启动子克隆及胚珠特异表达载体的构建

为了观察转基因植株胚珠特异性表达,采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体并对番茄进行遗传转化。根据已报道的INO启动子序列设计并合成一对特异引物,通过PCR对启动子进行扩增、连接并对其进行测序,结果表明：与GenBank中已注册的INO启动子序列的同源性为100%,并且构建了以INO代替CAMV35S启动子的pCAMBIA1304-L117植物表达载体,采用冷冻法将其转入根癌农杆菌EHA105。成功构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体,并为进一步检测奠定了基础。     

棉花种子特异性启动子的克隆及表达载体构建

种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具.Lea(Late embryogenesis abundant)蛋白是胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,因此,其调控序列可能提供一个很好来源的种子特异性表达启动子.为研究植物Lea蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,本研究通过PCR扩增,从亚洲棉(Gossy...     

转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。     

水稻26kDa球蛋白基因启动子克隆及序列分析

以水稻品种日本晴基因组总DNA为模板,采用PCR扩增获得约900bp大小的DNA片段,回收该片段并与pUCm-T载体连接,转化感受态大肠杆菌.进行PCR检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含904个核苷酸对;采用vector NTI软件将本试验中克隆的序列与Genbank（AY427575）公布的日本晴球蛋白基因启动子序列比对,有9个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻球蛋白基因启动子;在重要功能区段上,两者核苷酸序列完全一致.本研究认为造成长期不在一个环境中种植的同一水稻品种球蛋白基因启动子序列差异的原因之一,可能是核苷酸中性突变.水稻球蛋白基因启动子的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

玉米特异启动子驱动下结核Hsp65与Esat-6融合基因表达载体的构建及鉴定

利用转基因玉米研制新型结核口服疫苗.构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GHLE,并转化农杆菌LBA4404.以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-HLE联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.成功构建了pC1300GHLE质粒,酶切鉴定得到3.3 kb和8.6Kb2条带,测序分析表明克隆的H8p65和Esat6序列与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.成功构建和转化了pCl300GHLE表达载体,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础.     

番茄果实特异性启动子2A11的基因克隆及功能研究

采用巢式PCR技术从番茄基因组DNA克隆到长度1.3kp的果实特异性2A11启动子基因。序列分析表明,克隆到的基因序列2A11启动子转录起始位点上游的621bp处缺失了已报道的番茄2A11启动子基因（GenBank ID M87659,1993）序列中的“tatattgttaacttcttgttgaattaaagcaat”片段,其同源性为61%,登入GenBank,ID号为DQ453963;构建植物表达载体pCAMBIA2A11,用农杆菌介导侵染番茄果实,GUS基因瞬间表达结果表明,该2A11启动子基因具有驱动GUS基因在番茄果实中特异性表达的功能。研究结果表明成功地获得2A11果实特异性启动子基因,为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的基础。     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

携带结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体的构建及鉴定

构建包含结核杆菌Ag85B基因的植物表达载体,并转化农杆菌LBA4404。以pcDNA3-Ag85B为模板,通过常规PCR克隆出Ag85B基因,定向克隆至含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,然后将globulin-1-Ag85B的融合片段酶切下来,并连接到经过加工修饰的含有抗除草剂基因bar的双元表达载体pCAMBIA1300上,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404中。重组质粒双酶切可见0.8bp和10kb的两条特异性条带,与预期大小相一致。重组质粒测序表明克隆的Ag85B基因序列与Genbank上相一致,酶切从农杆菌中所抽提的质粒,片段大小与预期相一致。成功构建与转化了携带结核Ag85B基因的植物双元表达载体,为利用植物反应器生产口服结核疫苗奠定基础。     

巴西橡胶树乳管高效表达焦磷酸酶基因的双元表达载体的构建

以巴西橡胶树叶片为材料提取DNA,用特异引物经PCR扩增获得了378 bp的REF启动子片段,该片段序列与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.68 %和99.47 %。以胶乳为材料提取总RNA,用特异引物经RT-PCR方法获得了2310 bp的V-PPase基因片段,该片段序列与NCBI报道的V-PPase基因序列一致。通过酶切和连接,将克隆的两个片段重组到植物表达载体pCAMBIA1301, pCAMBIA2301和pCAMBIA3301中,构建了分别含有潮霉素磷酸转移酶基因（hpt Ⅱ）、新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）和抗除草剂基因（bar）的三种橡胶树乳管高效表达V-PPase基因的载体pC1301RV、pC2301RV和pC3301RV。然后用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,为进一步转化橡胶树奠定基础。     

甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区克隆及序列分析

根据已知的甘薯块根贮藏蛋白A基因序列, 设计和合成了两对PCR引物, 从南薯88基因组中分别扩增出该基因的启动子和启动子加信号肽编码区两种DNA片段, 并测定了它们的DNA序列。 将测定的序列与GenBank中的甘薯贮藏蛋白基因的相应序列进行同源性分析, 结果发现, 其中既有与GenBank中甘薯贮藏蛋白基因启动子完全相同的片段,