传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP2基因的克隆及序列分析

根据NCBIG GeneBank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒（vvIBDV）OKYM株的核苷酸序列，设计并合成1对特异性扩增IBDV主要宿主保护性抗原VP2基因的引物。从IBDV F9811感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA，经RT－PCR扩增出约1．5kb的基因片段，采用平端连接法将此基因片段克隆至pUC119质粒的Sma I位点上。经核苷酸序列测定，并与国内外其他vvIBDV VP2基因序列进行比较分析，发现F9811与OKYM在VP2基因上有18个核苷酸不同，但在氨基酸序列上仅212位存在差异，从而从分子生物学角度证明F9811为vvIBDV。对143－382氨基酸区域所作系统进化树分析表明，F9811、G9201与OKYM、UK661、HK46相近，而F9502、G9303与OKYM、UK661、HK46较远，说明我国存在许多不同的vvIBDV毒株。     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸡传染性法氏囊病病毒XX08株VP2高变区基因的克隆与序列分析

应用反转录(RT-PCR)技术从河南新乡某鸡场分离的鸡传染性法氏囊病病毒XX08株总RNA中克隆出593bp的VP2高变区基因。序列分析表明,XX08毒株VP2高变区氨基酸序列与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM以及经典弱毒株D78的同源性均为96.8%。遗传进化分析表明,该毒株与超强毒株UK661和OKYM位于同一进化树。XX08毒株与超强毒株具有相似的氨基酸特征,但是222位的A被P替代,提示XX08毒株可能为中等强毒力毒株。     

4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）,分别为河北株（HB）、湖北株（HUB）、山东株（SD）、山西株（SX）。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S（aa 326S-332S）,其222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位是传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S（aa 326S-332S）,其222（P）、256（V）、294（L）和299（N）位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。     

IBDV野毒株的分子生物学鉴定

取3个分离于山东地区几个鸡场IBDV野毒株IBDV SD01、IBDV SD02、IBDV SD03,利用Trizol试剂提取IBDV RNA,设计特定的引物,通过RT-PCR和Nested-PCR,获得分离株的VP2基因高变区的特定序列,并对其进行克隆和序列分析结果表明,分离的3个野毒株在VP2高变区与超强毒株HK46有较高的同源性,关键氨基酸位点都符合超强毒株的特征,与一般的强毒株、变异株和疫苗株的亲缘关系较远。这些关键位点氨基酸的变化使vvIBDV能够逃脱低毒力抗原所产生抗体的捕捉,导致了免疫鸡的发病。     

鸡传染性囊病病毒青岛分离株VP2基因的克隆及序列分析

为了克隆传染性囊病病毒青岛分离株(IBDV-QD)的VP2 基因及对其高变区序列进行分析,首先根据GenBank上已经发表的传染性囊病病毒(IBDV)UK661株的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV-QD VP2 基因的引物.以IBDV-QD株基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约1.5 kb的基因片段,将其连接到pGEM-T-Easy载体上.经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株VP2基因的重组质粒.将IBDV-QD株VP2基因的高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的14株IBDV相应序列应用软件进行同源性比较,并构建系统进化树.同源性比较和进化树分析表明,IBDV-QD与IBDV超强毒株(vvIBDV)关系最近,与标准强毒株、弱毒株、变异株相差较远;并且我国不同地区的vvIBDV存在差异,这为我国传染性囊病的流行病学调查奠定了基础.     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列，设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物。以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板，用RT-PCR扩增出了1．45kb的cDNA产物，将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上，获得了pMD18-T-VP2重组质粒。将IBDV HN01株VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较，绘出系统进化树。结果表明，HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP_2基因的克隆及序列分析

根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3～ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv IBDV毒株     

鸡传染性法氏囊病毒JS株毒力测定

35日龄SPF鸡半数致死量(LD50)和9日龄SPF鸡胚半数致死量(ELD50)试验结果显示,传染性法氏囊病毒(1BDV)JS株的LD50为10-3.60.1 mL/只,ELD50为10-5.20.1 mL/胚;1～6周龄SPF鸡及商品鸡的致病性试验结果显示,IBDV JS株对SPF鸡和商品鸡3周龄后的致病率为100%,最高致死率分别为93.75%和75%;应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增的VP2基因,经序列测定分析结果显示,IBDV JS株的VP2基因与香港HK46、日本OKYM、英国UK661等国际超强毒株的氨基酸序列的同源性达99%以上.表明IBDV JS株为超强毒株.     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus C4 Strain

This study was aimed to investigate the relationship between the virulence characteristics of infectious bursal disease virus(IBDV) C4 strain and its VP2 amino acid sequence. The RNA of IBDV C4 strain was extracted,and its VP2 gene was amplified by RT-PCR.VP2 nucleotide sequences and deduced amino acids of different virulent IBDV strains were compared. At the same time, prokaryotic expression vector pET-32a(+) was used to express the VP2 gene. The expression of recombinant VP2 protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that the VP2 gene of IBDV C4 strain belonged to the very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) in evolutionary relationship, the VP2 nucleotides homology between IBDV C4 strain and other vvIBDV strains were 98.1% to 98.7%, and there were no mutations in S-W-S-A-S-G-S (326-332 amino acids) and 222(A), 256(I), 294(I) and 299(S). The VP2 amino acid sequence of IBDV C4 strain was consistent with the characteristics of other vvIBDV strains. However, there were three differences amino acids sites at 201(D/G), 281(G/R) and 313(V/A) between the amino acids of the C4 strain and the very virulent strain UK661. And the change of 281(R) was in the small hydrophilic region of 279 to 290, which was related to the antigenicity of the virus; The recombinant VP2 protein molecular weight expressed in Escherichia coli BL21 was about 67 ku. This study provided a basis for further research on antigenic changes resulting from amino acid variation of 201(G), 281 (R) and 313(A). These results indicated that the VP2 gene of the IBDV C4 strain was consistent with the major characteristics of the vvIBDV strain VP2 gene. The difference of three amino acid sites in the vvIBDV strain C4 might be related to the evolution of virulence of IBDV strain in China.     

传染性法氏囊病病毒VP2-4-3 cDNA的分子克隆和序列分析

从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析

为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。