鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒（MDPV）强毒Q株经番鸭胚连续传代，获得致弱株MDPV－26，根据已发表的MDPV的全基因序列，设计了1对引物LHMP7／LHMP8，同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶Sac Ⅱ和KpnⅠ的酶切位点，应用PCR技术扩增了MDPV0－26株的VP2基因片段，将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，测序结果表明，弱毒株MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列相同率达99．7％，与国外分离株的同源性为98．3％，说明强，弱毒株的VP2基因序列变化不大。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列，设计并合成了一对特异扩增IBDVvP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料，以其基因组为模板利用RT—PCR技术扩增出了1．5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于PUC119质粒上，得到重组PUC119质粒。对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明，YL株与欧洲超强毒株非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

IBDV不同分离株VP2高变区的基因序列分析

对9个IBDV(传染性法氏囊病毒)分离株的、VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段分析比较9个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区（Aeel-Spell)的氨基酸序列，并构建进化树、结果表明，9个IBDV分离株是超强毒株，并且得出亚洲目前流行的、rvIBDVs与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达

RT-PCR扩增获得4株鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)分离株(GT、HN、ZB、BZ)VP2基因并测序,序列分析结果表明:各基因全长均为1356bp,编码452个氨基酸残基;核苷酸、氨基酸序列同源性分别在93.2%～99.9%与93.6%～100%之间;除HN株与经典毒株Cu-1核苷酸同源性为95.5%外,其余3株均为95.6%;GT、HN、ZB及BZ株与VariantE株核苷酸同源性均为95.9%;该4株病毒与北欧、非洲、西亚、东南亚、东亚等地区于1998～2008年报道的超强毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均非常高。根据VP2蛋白氨基酸序列特征,HN、ZB、BZ株病毒皆为超强毒株(vvIBDV),GT株除254位氨基酸残基为变异株特征性的S(丝氨酸)外,其余均与超强毒株特征相符。以GT株VP2基因克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌BL21(DE3),低温培养后42℃热诱导,并对诱导产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果显示,目的基因获得表达,并与阳性抗体具有良好的反应原性,为以VP2为基础的基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

为探索一个已免疫传染性法氏囊病活疫苗的817肉鸡场在免疫后发生IBD的原因,本研究对病料进行病毒分离,通过RT-PCR扩增分离株VP2基因后进行相关分析,并对分离株的致病性进行测定。结果显示,分离到一株传染性法氏囊病病毒,将其命名为ZHA001株;ZHA001株 VP2 基因序列与参考株的同源性为 90.1%～97.9%,与超强毒株氨基酸序列同源性大于99%;具有超强毒株的特征性氨基酸位点;遗传进化分析发现,ZHA001株属于超强毒株分支;致病性试验中,发病率为100%,致死率为90%。结果表明：IBDV ZHA001株为超强毒病毒。     

鸡传染性法氏囊病毒江苏地方株的分离及其VP2基因分析

用SPF鸡胚从江苏溧水某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到1株法氏囊病毒(IBDV-LS株),该病毒不能凝集鸡的红细胞,琼扩试验证明与IBDV标准阳性血清发生反应,应用RT-PCR扩增IBDV VP2基因,测序后并与GenBank中的IBDV已知序列进行比较。结果表明,分离的IB-DV-LS与国内外超强毒的核苷酸同源性在94.6%以上,推导氨基酸同源性96.6%,并与超强毒株处于进化树同一分支;说明IBDV-LS属IBDV超强毒株,而亲水区内个别氨基酸的替换,提示该毒株已发生一定的变异。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的序列分析

将番鸭细小病毒强毒株MDPV－Q经番鸭胚传代，获得致弱株MDPV－26，应用PCR技术扩增MDPV－26株的VP2基因片段，将扩增后的VP2基因重组到pMD 18-T质粒载体上，并对插入片段进行序列测定，将测定结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV－Q株及国外已发表的MDPV相应序列进行同源性比较及分析，结果表明，MDPV－26与强毒株MDPV－Q的VP2基因序列及与国外分离株均具有很高的同源性。     

鸡传染性法氏囊病病毒分离鉴定及具VP2基因高变区序列分析

利用SPF鸡胚培养法,自安徽两个不同鸡场分离到2株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为AH01和AH002.为了解其致病特性,进行了鸡胚半数致死量(ELD50)测定、动物回归实验、VP2基因片段的扩增与分析.结果显示,AH01和AH02第一代尿囊膜悬液病毒的ELD50值分别为104.7/0.2 mL和105.3/0.2 mL,人工感染致死率分别为60％和73.3％;两分离株间的核苷酸同源性为97.8％,与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为96.0％～97.2％和96.7％～98.6％,提示其VP2高变区序列符合IBDV超强毒株特征.     

传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

从中国广东省发生传染性法氏囊病的鸡场分离了8株传染性囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,运用RT-PCR对分离毒株进行了鉴定,测定了8个分离株的ELD50以及其对SPF鸡的致死率。结果表明:这8株分离毒对SPF鸡的致死率均等于或超过60%,属于超强毒。运用RT-PCR方法对分离毒株进行了鉴定并对各毒株VP2基因高变区进行扩增测序,分析结果表明:这8株分离株均为IBDV超强毒株,同时也说明当前在广东省引起鸡传染性法氏囊病的主要毒株类型多为超强毒IBDV。     

IBDV野毒株的分子生物学鉴定

取3个分离于山东地区几个鸡场IBDV野毒株IBDV SD01、IBDV SD02、IBDV SD03,利用Trizol试剂提取IBDV RNA,设计特定的引物,通过RT-PCR和Nested-PCR,获得分离株的VP2基因高变区的特定序列,并对其进行克隆和序列分析结果表明,分离的3个野毒株在VP2高变区与超强毒株HK46有较高的同源性,关键氨基酸位点都符合超强毒株的特征,与一般的强毒株、变异株和疫苗株的亲缘关系较远。这些关键位点氨基酸的变化使vvIBDV能够逃脱低毒力抗原所产生抗体的捕捉,导致了免疫鸡的发病。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP2基因的克隆及序列分析

根据NCBIG GeneBank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒（vvIBDV）OKYM株的核苷酸序列，设计并合成1对特异性扩增IBDV主要宿主保护性抗原VP2基因的引物。从IBDV F9811感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA，经RT－PCR扩增出约1．5kb的基因片段，采用平端连接法将此基因片段克隆至pUC119质粒的Sma I位点上。经核苷酸序列测定，并与国内外其他vvIBDV VP2基因序列进行比较分析，发现F9811与OKYM在VP2基因上有18个核苷酸不同，但在氨基酸序列上仅212位存在差异，从而从分子生物学角度证明F9811为vvIBDV。对143－382氨基酸区域所作系统进化树分析表明，F9811、G9201与OKYM、UK661、HK46相近，而F9502、G9303与OKYM、UK661、HK46较远，说明我国存在许多不同的vvIBDV毒株。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP_2基因的克隆及序列分析

根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3～ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv IBDV毒株     

广西某鸡群呼吸道综合征的病原学分析

本研究对临床上患呼吸道感染的病鸡进行病原检测,分离到1株传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)和1株传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),此外还从病鸡肝脏等组织中分离到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。对IBDV分离株NN160401的VP1-b、v VP2基因以及IBV分离株GX160421的S1基因分别进行扩增、测序以及序列的相似性比较和遗传进化树分析。结果发现,分离株NN160401为基因重排毒株,其VP1-b与HLJ-0504株的序列相似,v VP2则具有IBDV超强毒株特征;分离株GX160421的S1基因序列与广西分离株亲缘关系较近,属于近年报道的New-typeⅡ,但与其他参考株及疫苗株H120的核苷酸相似性仅为58.8%~67.2%。综合分析表明,该病鸡群为早期感染IBDV造成了机体的免疫抑制,后来继发IBV的感染并伴发了细菌感染。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒洛阳分离株VPP2基因的原核表达及鉴定

根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。     

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株，对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列，构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明，15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行，且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。