鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株,对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序,得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列,构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明,15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行,且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

鸡传染性法氏囊病分子流行病学研究

15个江苏省IBDV分离株，对其VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段。分析比较15个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区(AccI-SpeI)推断的氨基酸序列，构建进化树。氨基酸序列分析以及进化树分析表明，15个IBDV分离株是超强毒株。而且目前vvIBDVs在亚洲各个国家流行，且与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

IBDV不同分离株VP2高变区的基因序列分析

对9个IBDV(传染性法氏囊病毒)分离株的、VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段分析比较9个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区（Aeel-Spell)的氨基酸序列，并构建进化树、结果表明，9个IBDV分离株是超强毒株，并且得出亚洲目前流行的、rvIBDVs与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

为探索一个已免疫传染性法氏囊病活疫苗的817肉鸡场在免疫后发生IBD的原因,本研究对病料进行病毒分离,通过RT-PCR扩增分离株VP2基因后进行相关分析,并对分离株的致病性进行测定。结果显示,分离到一株传染性法氏囊病病毒,将其命名为ZHA001株;ZHA001株 VP2 基因序列与参考株的同源性为 90.1%～97.9%,与超强毒株氨基酸序列同源性大于99%;具有超强毒株的特征性氨基酸位点;遗传进化分析发现,ZHA001株属于超强毒株分支;致病性试验中,发病率为100%,致死率为90%。结果表明：IBDV ZHA001株为超强毒病毒。     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行株VP1基因片段的扩增及序列分析

为了解鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)地方流行毒株在基因组B节段关键序列上的分子进化情况,通过反转录PCR(RT-PCR)技术对6个IBDV不同地方分离株的VP1基因中与病毒致病型相关的一个片段(1 518bp~1 997bp,共480bp)进行扩增,并对所获得的VP1 480bp片段进行核苷酸的序列测定,与IBDV参考株和常用疫苗株的相应序列进行比较分析和绘制遗传进化树。结果表明,6个分离株与参考株在VP1RNA聚合酶基序Ⅵ和基序Ⅶ上均保守,在特征性氨基酸位点上,3个广西分离株QX0604、WZ0704和NN0603与参考的vvIBDV相同,而分离株BH111(广西)、JS17(江苏)和HUN0804(湖南)则既具有vvIBDV的位点特征,又具有经典毒株特征,但不同毒株在不同位点上表现不同;在同源性分析上,JS17、BH111、QX0604、WZ0704和NN0603等5个毒株与参考用vvIBDV毒株的同源性较高,在核苷酸和氨基酸水平上分别为92.5%~100.0%和97.5%~100.0%,但与2个常用疫苗株和经典毒株的同源性仅分别为87.9%~90.0%和96.2%~96.9%,分离株HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株更接近;在遗传进化树上,JS17和BH111等5个分离株与vvIBDV在一个分支上,亲缘关系更近,而HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株在另一个大分支。表明不同分离株在VP1的功能基序上保持保守,但分离株在特征性氨基酸位点上则发生了变化,大多数分离株与常用疫苗株之间的同源性较低,亲缘关系较远。     

4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）,分别为河北株（HB）、湖北株（HUB）、山东株（SD）、山西株（SX）。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S（aa 326S-332S）,其222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位是传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S（aa 326S-332S）,其222（P）、256（V）、294（L）和299（N）位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

广西梧州地区近十年传染性法氏囊病病毒vVP2变化特征分析

为了解近10年来广西梧州地区鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)分子进化情况,对2013年—2014年间来自该地区传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)的法氏囊样品进行IBDV的分离鉴定,并对分离株以及课题组2006年—2013年间分离的毒株,共24株的VP2高变区(vVP2)进行序列分析和遗传进化分析。结果表明,QX0601等23个分离株在关键氨基酸位点上具有256I、284A、294I等超强毒株(vvIBDV)的分子特征,遗传进化分析表明,这23株分离株与UK661、HK46等超强毒参考株同处一个分支中,亲缘关系较近;QX110603在关键性氨基酸位点上则具有256V、284T、294L等弱毒株的特征,遗传进化分析显示,其与BJ836等致弱株处于同一分支,亲缘关系较近。对所有分离株进行氨基酸位点分析发现,该地区IBDV进化出现了新的特点,212D-212N符合国内近年来的分离株的变化趋势,209T-209A、338R-338H、359T-359R则表现出地域特点,未曾见过相似报道。研究结果表明,具有vvIBDV分子特征的分离株是该地区近10年来主要流行毒株,该地区IBDV毒株在vVP2序列上仍处于不断进化中,且带有地域特点。     

传染性法氏囊病病毒VP2-4-3 cDNA的分子克隆和序列分析

从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列，设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物。以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板，用RT-PCR扩增出了1．45kb的cDNA产物，将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上，获得了pMD18-T-VP2重组质粒。将IBDV HN01株VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较，绘出系统进化树。结果表明，HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

一株鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

从天津地区免疫失败的鸡群中分离一株IBDV(命名TJ-hg),应用血清学AGP试验结果可见明显的白色沉淀线;应用逆转录酶—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的 IBDV VP2 基因高变区(vVP2)及其序列分析的结果表明,TJ-hg株与超强毒株的核苷酸同源性均在90%以上,氨基酸同源性达98.8%~99.3%,且高变区中特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,TJ-hg株在第一亲水区氨基酸Q219P发生突变。研究结果表明,TJ-hg株属于超强毒株,但又与标准毒株存在差异。     

不同时期8株IBDV地方株VP2基因变异分析

对分离于洛阳地区1991和2001年前后间隔达10年之久的两个时期的8株IBDV进行了VP2基因的克隆与序列分析。结果发现，8个地方株虽均属于IBDV超强毒株，但各个毒株间也有一定的差异。根据它们的核苷酸和氨基酸同源性高低可明显分为3群，分别位于系统进化树上超强毒区的3个小分支上。第1群包括1991年分离的L912、L014和L916三株；第2群包括L913、L017和L018三株；第3群包括2001年分离的L015和L016二株。群内各毒株间同源性较高，在98．3％～100％之间；群间各毒株的同源性则相对较低，在95％～97．9％之间，其中最低的为L015和L017、L016和L018二对，同源性均只有95％。进一步的序列分析表明，8个地方分离株均具有vvIBDV所具有的特征。其中，1991年的4株在各亲水区和七肽区的氨基酸和经典株及传统的超强毒株相比均无明显的变化；而2001年的4个分离株虽仍符合超强毒株的特点，但在相应亲水区均有1～2个氨基酸发生替换，特别是L015和L016株还出现了4个其它各毒株均没有的氨基酸位点变化。     

应用Mab-basedAC—ELISA法对鸡IBDV分离株的抗原特性分析

为了解传染性法氏囊病病毒（IBDV）的抗原变异分子基础,采用Mab—basedAC—ELISA方法,利用11株单抗对2株河北IBDV分离株进行了抗原特性分析,并比较了超强毒株和弱毒株的VP2高变区序列的分子特征。结果显示：强弱毒株的抗原位点结合单抗的能力明显不同,除了Mab3、Mab9外,其余9个单抗的结合能力,超强毒株要高于弱毒株。超强毒株HeB-If缺少了Mab3结合位点,弱毒株HeB-bdjz缺少了Mab3、Mab6结合住点,这说明强弱毒株不仅在序列上有差异,而且在抗原位点的缺失上也存在差异。本试验为控制IBD和疫苗改进具有重要意义。     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）浙江分离株（ZJ2000）基因组RNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了IBDV ZJ2000株基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，克隆的A节段全长共3259个核苷酸，包括5'、3'端的非编码区（NCRs）和2个部分重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与参比的血清1型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％－99．2％。二级结构预测表明，在5'-NCRs存在1个大型的茎环发夹结构。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比毒株的同源性高达98．6％－100％。ORF1编码1012个氨基酸的VP2／VP4／VP3，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达到94．9％－98．8、96．1％－98．5％、97．1％－99．2％。ZJ2000共有14－38氨基酸的替代，其中特有氨基酸6个，变异大多数集中在VP2高变区，突变率达2．9％－11％。第2个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L。这2个突变可能与IBDV的抗原性有关。VP2－VP4剪切位点附近511和540位氨基酸的变异可能使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000与欧洲Cu-1株、P2株、CEF94株和中国Harbin株的有关最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列，设计并合成了一对特异扩增IBDVvP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料，以其基因组为模板利用RT—PCR技术扩增出了1．5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于PUC119质粒上，得到重组PUC119质粒。对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明，YL株与欧洲超强毒株非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸡传染性法氏囊病毒江苏地方株的分离及其VP2基因分析

用SPF鸡胚从江苏溧水某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到1株法氏囊病毒(IBDV-LS株),该病毒不能凝集鸡的红细胞,琼扩试验证明与IBDV标准阳性血清发生反应,应用RT-PCR扩增IBDV VP2基因,测序后并与GenBank中的IBDV已知序列进行比较。结果表明,分离的IB-DV-LS与国内外超强毒的核苷酸同源性在94.6%以上,推导氨基酸同源性96.6%,并与超强毒株处于进化树同一分支;说明IBDV-LS属IBDV超强毒株,而亲水区内个别氨基酸的替换,提示该毒株已发生一定的变异。     

传染性法氏囊病病毒山西株的鉴定及毒力分析

研究通过对山西某养鸡场送检疑似鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的病鸡采集病料,设计引物进行PCR鉴定,扩增出831 bp的特异性片段,初步确定病鸡感染IBDV。扩增分离病毒的VP2和VP3片段序列并进行同源性比对和构建系统发育进化树,而后进行生物学毒力测定试验和动物回归试验。结果显示:VP2和VP3扩增出总长度为474 bp和771 bp的片段;VP2序列中七肽氨基酸顺序为SWSARGS,且在222、253、256、279、284、294、299位点的氨基酸分别为P、H、V、N、T、L、N,均与标准弱毒株相同;分离株VP2序列与B87和Gt株的同源性最高,与B87和Gt株等处于同一个分支;分离株VP3序列与B87和Gt株的同源性最高,且与之位于同一个分支;病毒生物学毒力试验结果显示,分离株的MDT、IVPI、ICPI分别是120 h、0、0.4。确定分离的IBDV为弱毒株;动物回归试验结果显示,发病SPF鸡剖检有典型的传染性法氏囊病病变,表明分离株具有明显的致病性。