山东省鸡传染性法氏囊病流行现状及病毒特性

用RT-PCR方法对山东省疑似传染性法氏囊病(IBD)组织样品进行检测,对阳性样品进行了病毒分离,设计引物扩增出分离病毒的全基因组。谱系分析表明,除WF株外,其他分离株与国内大部分强毒株位于同一个谱系。序列分析表明,LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN分离株VP2七肽基序均为S-W-S-A-S-G-S,在第222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。攻毒试验表明,LY株产生明显IBD病变,死亡率为40%(2/5),为强毒株,结果与序列分析一致。WF株与B87和Gt疫苗株位于同一谱系,VP2分子特征也与Gt弱毒株相同,攻毒试验显示WF株为弱毒株。同源性分析表明,LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN与国内分离的强毒株之间VP2氨基酸序列的同源性为93.3%~99.8%,与现行商品疫苗毒株B87和Gt的VP2氨基酸序列同源性分别为94.1~96.2%和94.5~96.9%;WF分离株与国内分离株之间VP2氨基酸同源性为95.6%~99.2%,与疫苗株B87和Gt株VP2氨基酸同源性分别为99.2%和99.6%。本文对山东省流行的鸡传染性法氏囊病毒进行了分子流行病学分析,对病毒的基因组学和致病性进行了初步研究,此研究对了解本病的流行现状,分析病毒变异规律具有重要意义。     

鸡传染性法氏囊病病毒弱毒株在鸡体连续传代后毒力增强的分子机理研究

将两株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）弱毒株在SPF鸡体内连续传代至第5、第6代时,出现明显的法氏囊萎缩和B：B指数下降,表明IBDV弱毒株在鸡体内连续传代后毒力增强。为进一步阐释哪些基因位点导致了上述毒力的变化,本试验测定了基础弱毒株及其在鸡体内传代后各个代次毒的基因组序列,比对分析后发现VP2蛋白253位氨基酸发生了由H到Q或N的变异,表明VP2蛋白253位氨基酸的替换可能会增强传染性法氏囊病病毒在鸡体内的致病性。     

传染性法氏囊病病毒 PY05 株的分离鉴定

为了分离到鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）病毒,从河南省濮阳地区某疑似感染鸡法氏囊病病毒的鸡场采集病料,用SPF鸡胚对病毒进行分离培养,通过琼脂扩散试验和RT-PCR扩增VP4片段对其进行鉴定。结果显示该毒株能引起鸡胚规律性死亡,且出现CAM增厚、鸡胚出血等明显病变;待检抗原、标准阳性血清之间出现阳性沉淀线;琼脂电泳得到大小约为1200bp片段,与预期结果相符。结果证明该分离株为IBDV地方株,并命名为PY05株。     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

一步法扩增IBDV上海株全长基因组cDNA

为了研究鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）上海株的全部核苷酸序列，应用蛋白酶K消化、割胶纯化获得了高纯度的dsRNA，应用随机引物合成了cDNA的第一链。参照基因库中相关IBDV毒株的基因序列，设计合成了两对引物，一步扩增出IBDV上海株全长基因组cDNA的A片段和B片段。为了验证获得的A片段和B片段的正确性，以扩增出的A片段为模板，成功扩增出的IBDV的VP2基因，并应用T载体进行了克隆和测序，测序结果显示，其与国内外数株IBDV毒株的同源性很高，表明醉建立的扩增IBDV全长基因组cDNA的一步法正确、可行。     

鸡传染性法氏囊病病毒秦皇岛株的分离鉴定

将秦皇岛某养鸡场疑似为传染性法氏囊病的病死鸡进行剖检,为了对该疑似病例进行确诊,并进行流行病学研究,经对流免疫电泳,对采集的病料进行病毒的分离,阳性法氏囊病料进行病毒RNA的提取,采用套式RT-PCR对病毒的VP2高变区进行扩增,分析氨基酸序列。结果表明,该分离株为传染性法氏囊病病毒(IBDV),被检毒株与GenBank报道的标准超强毒株OKYM、UK661、DV86同源性高达100%,与V3、V2亲缘关系较近。动物回归试验可使健康鸡100%发病,病死率80%。表该分离株为鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株。     

鸽源传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及其A、B节段序列扩增

目的:分离鉴定鸽源传染性法氏囊病病毒(IBDV),扩增其基因组A、B节段cDNA.方法:采用SPF鸡胚尿囊腔接种分离IBDV,RT-PCR鉴定并扩增A、B节段全基因组DNA,进行同源性比较,初步分析分离株序列特征.结果:该分离株经RT-PCR特异性鉴定引物鉴定为强毒株,与强毒株相比,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性99%.     

鸡传染性法氏囊病病毒PCR检测及VP4基因序列分析

从滨州地区某养鸡场疑似鸡传染性法氏囊病病鸡初步分离到一株记为HSJ12分离株的IBDV毒株,从该分离株中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增VP4基因。结果表明,测序结果与GenBank中报道的IBDV VP4序列同源性在95%～99%之间。将VP4基因测序序列与GenBank上报道的23个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与ks株同源性最近,而与23-82、OH株同源性最远。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

为探索一个已免疫传染性法氏囊病活疫苗的817肉鸡场在免疫后发生IBD的原因,本研究对病料进行病毒分离,通过RT-PCR扩增分离株VP2基因后进行相关分析,并对分离株的致病性进行测定。结果显示,分离到一株传染性法氏囊病病毒,将其命名为ZHA001株;ZHA001株 VP2 基因序列与参考株的同源性为 90.1%～97.9%,与超强毒株氨基酸序列同源性大于99%;具有超强毒株的特征性氨基酸位点;遗传进化分析发现,ZHA001株属于超强毒株分支;致病性试验中,发病率为100%,致死率为90%。结果表明：IBDV ZHA001株为超强毒病毒。     

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）,分别命名为QL和ZZ—ll,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96．8％～98．1％和96．9％～98．4％,处在IB—DV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89．7％～90．4％和90．0％～90．7％,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ—11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777～782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ—11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。     

鸡传染性法氏囊病毒江苏地方株的分离及其VP2基因分析

用SPF鸡胚从江苏溧水某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到1株法氏囊病毒(IBDV-LS株),该病毒不能凝集鸡的红细胞,琼扩试验证明与IBDV标准阳性血清发生反应,应用RT-PCR扩增IBDV VP2基因,测序后并与GenBank中的IBDV已知序列进行比较。结果表明,分离的IB-DV-LS与国内外超强毒的核苷酸同源性在94.6%以上,推导氨基酸同源性96.6%,并与超强毒株处于进化树同一分支;说明IBDV-LS属IBDV超强毒株,而亲水区内个别氨基酸的替换,提示该毒株已发生一定的变异。     

IBDV不同分离株VP2高变区的基因序列分析

对9个IBDV(传染性法氏囊病毒)分离株的、VP2高变区进行RT-PCR扩增、测序，得到约560bp长的片段分析比较9个IBDV分离株与参考毒株的VP2高变区（Aeel-Spell)的氨基酸序列，并构建进化树、结果表明，9个IBDV分离株是超强毒株，并且得出亚洲目前流行的、rvIBDVs与欧洲国家的vvIBDVs的进化关系很近。     

鸡传染性法氏囊病病毒分离鉴定及具VP2基因高变区序列分析

利用SPF鸡胚培养法,自安徽两个不同鸡场分离到2株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为AH01和AH002.为了解其致病特性,进行了鸡胚半数致死量(ELD50)测定、动物回归实验、VP2基因片段的扩增与分析.结果显示,AH01和AH02第一代尿囊膜悬液病毒的ELD50值分别为104.7/0.2 mL和105.3/0.2 mL,人工感染致死率分别为60％和73.3％;两分离株间的核苷酸同源性为97.8％,与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为96.0％～97.2％和96.7％～98.6％,提示其VP2高变区序列符合IBDV超强毒株特征.     

中国部分地区传染性法氏囊病病毒分子流病学调查

为调查我国鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的流行情况,从我国11个省(市、自治区)采集法氏囊病料,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒20株,运用RT-PCR方法对分离株的VP2基因进行扩增、测序和序列分析.研究表明,20株分离毒株中有19株具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S,与我国IBDV超强毒Gx株的核苷酸同源率在96.7%～99.4%,推导氨基酸同源率在98.2%～100% 遗传进化分析表明,所有分离毒株具有共同的祖先.     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行株VP1基因片段的扩增及序列分析

为了解鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)地方流行毒株在基因组B节段关键序列上的分子进化情况,通过反转录PCR(RT-PCR)技术对6个IBDV不同地方分离株的VP1基因中与病毒致病型相关的一个片段(1 518bp~1 997bp,共480bp)进行扩增,并对所获得的VP1 480bp片段进行核苷酸的序列测定,与IBDV参考株和常用疫苗株的相应序列进行比较分析和绘制遗传进化树。结果表明,6个分离株与参考株在VP1RNA聚合酶基序Ⅵ和基序Ⅶ上均保守,在特征性氨基酸位点上,3个广西分离株QX0604、WZ0704和NN0603与参考的vvIBDV相同,而分离株BH111(广西)、JS17(江苏)和HUN0804(湖南)则既具有vvIBDV的位点特征,又具有经典毒株特征,但不同毒株在不同位点上表现不同;在同源性分析上,JS17、BH111、QX0604、WZ0704和NN0603等5个毒株与参考用vvIBDV毒株的同源性较高,在核苷酸和氨基酸水平上分别为92.5%~100.0%和97.5%~100.0%,但与2个常用疫苗株和经典毒株的同源性仅分别为87.9%~90.0%和96.2%~96.9%,分离株HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株更接近;在遗传进化树上,JS17和BH111等5个分离株与vvIBDV在一个分支上,亲缘关系更近,而HUN0804则与经典毒株和2个疫苗株在另一个大分支。表明不同分离株在VP1的功能基序上保持保守,但分离株在特征性氨基酸位点上则发生了变化,大多数分离株与常用疫苗株之间的同源性较低,亲缘关系较远。     

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3 260bp、B节段长度2 827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8%⁹8.1%和96.9%98.1%和96.9%⁹8.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%98.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%⁹0.4%和90.0%90.4%和90.0%⁹0.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段77790.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777⁷82位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnⅠ酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。     

4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）,分别为河北株（HB）、湖北株（HUB）、山东株（SD）、山西株（SX）。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S（aa 326S-332S）,其222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位是传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S（aa 326S-332S）,其222（P）、256（V）、294（L）和299（N）位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。     

鸡传染性法氏囊病病毒基因组A片段cDNA序列分析

用鸡胚成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）天水毒株。用提纯的病毒颗粒提取基因组RNA。根据已报道的英国52／70株的序列设计引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得1558bp和1590bp两个部分重叠的片段。结果表明，所克隆片段为3099的IBDV大开放读框。经与已报道的多个毒株相应序列比较后发现，核苷酸同源性介于97.4%-99.8%之间，推导的氨基酸同源性介于98.1%-99.5%。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

传染性法氏囊病病毒的分离与鉴定

从中国广东省发生传染性法氏囊病的鸡场分离了8株传染性囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)毒株,运用RT-PCR对分离毒株进行了鉴定,测定了8个分离株的ELD50以及其对SPF鸡的致死率。结果表明:这8株分离毒对SPF鸡的致死率均等于或超过60%,属于超强毒。运用RT-PCR方法对分离毒株进行了鉴定并对各毒株VP2基因高变区进行扩增测序,分析结果表明:这8株分离株均为IBDV超强毒株,同时也说明当前在广东省引起鸡传染性法氏囊病的主要毒株类型多为超强毒IBDV。