4株IBDV分离株VP2基因的序列分析及原核表达

RT-PCR扩增获得4株鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)分离株(GT、HN、ZB、BZ)VP2基因并测序,序列分析结果表明:各基因全长均为1356bp,编码452个氨基酸残基;核苷酸、氨基酸序列同源性分别在93.2%～99.9%与93.6%～100%之间;除HN株与经典毒株Cu-1核苷酸同源性为95.5%外,其余3株均为95.6%;GT、HN、ZB及BZ株与VariantE株核苷酸同源性均为95.9%;该4株病毒与北欧、非洲、西亚、东南亚、东亚等地区于1998～2008年报道的超强毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性均非常高。根据VP2蛋白氨基酸序列特征,HN、ZB、BZ株病毒皆为超强毒株(vvIBDV),GT株除254位氨基酸残基为变异株特征性的S(丝氨酸)外,其余均与超强毒株特征相符。以GT株VP2基因克隆至原核表达载体pBV220,转化大肠杆菌BL21(DE3),低温培养后42℃热诱导,并对诱导产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果显示,目的基因获得表达,并与阳性抗体具有良好的反应原性,为以VP2为基础的基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒山西株的鉴定及毒力分析

研究通过对山西某养鸡场送检疑似鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的病鸡采集病料,设计引物进行PCR鉴定,扩增出831 bp的特异性片段,初步确定病鸡感染IBDV。扩增分离病毒的VP2和VP3片段序列并进行同源性比对和构建系统发育进化树,而后进行生物学毒力测定试验和动物回归试验。结果显示:VP2和VP3扩增出总长度为474 bp和771 bp的片段;VP2序列中七肽氨基酸顺序为SWSARGS,且在222、253、256、279、284、294、299位点的氨基酸分别为P、H、V、N、T、L、N,均与标准弱毒株相同;分离株VP2序列与B87和Gt株的同源性最高,与B87和Gt株等处于同一个分支;分离株VP3序列与B87和Gt株的同源性最高,且与之位于同一个分支;病毒生物学毒力试验结果显示,分离株的MDT、IVPI、ICPI分别是120 h、0、0.4。确定分离的IBDV为弱毒株;动物回归试验结果显示,发病SPF鸡剖检有典型的传染性法氏囊病病变,表明分离株具有明显的致病性。     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

山东地区水貂肠炎病毒VP_2基因的克隆和测序分析

本研究对潍坊、烟台、威海和青岛地区的疑似水貂病毒性肠炎病毒(MEV)粪便样品进行检测,并在9份样品QD1309、QD1407、WH1407、WH1408、WH1508、WH1509、WF1310、WF1408、YT1408中扩增出VP2基因,和Gen Bank上已经公布的4株MEV参考株的VP_2基因进行序列分析,结果显示,13份MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为97.5%~99.8%和96.9%~99.7%。系统发育进化树表明,QD1309、YT1408、MEV-Beregovoj-Bincentr(MEV-BB)、MEV-e属于同一个组群,不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换。本研究对水貂细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP_2的编码蛋白进行遗传变异分析,为更好地预防和控制貂源细小病毒提供基础。     

广西地区传染性囊病病毒超强毒株的分离鉴定及其VP2基因高变区的序列分析

研究通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、琼脂扩散试验、致细胞病变和RT-PCR等方法,成功从广西疑似病鸡的腔上囊组织中获得了8个传染性囊病病毒(IBDV)毒株,分离株可致攻毒鸡发病率100%,死亡率60%～90%;分子特征上,8个分离株VP2高变区在酶切位点和特征性氨基酸上均属于vvIBDV的特征.同源性分析表明,8个分离株之间在核苷酸和氨基酸上的同源性分别为96.8%～99.1%和95.9%～99.3%,与其他参考vvIBDV毒株的同源性分别为94%～97.7%和92.5%～97.3%,而与常用疫苗株Bursine-2、B87(in),变异株GLS,经典强毒株的同源性仅有90%左右.遗传进化树上,8个分离株与国内外参考vvIBDV同处于一个大分支,与疫苗株和经典强毒株的距离较远,8个分离株与中国内地毒株SD1/97的亲缘关系最近.研究表明,广西仍然存在vvIBDV的流行.     

山东省不同毒力新城疫病毒的分离与鉴定

从山东省8个地区22个养禽场82份疑似新城疫病料中,分离和鉴定出12株新城疫病毒(NDV)。将12株NDV进行了最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI)检测,结果表明,6个分离株(WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株)MDT均小于60 h,ICPI均大于1.6、IVPI均在2.00以上,为强毒株;DY2、LC3和BZ7株的MDT分别为63.6 h、69.6 h和62.4 h,ICPI值为1.4、1.44和1.35,IVPI值为1.74、1.85和1.49,为中毒力毒株;WF3、LY14和TA6株为弱毒株。动物回归试验证明,除WF3、LY14和TA6株外,其他分离毒株均可以引起雏鸡发病,并出现明显病变。     

一株G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。     

不同禽源副黏病毒分离株F基因的克隆与序列分析

分别对鸡源、鸭源、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒分离株(WF00C、WF00D、WF00G)的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析.结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框(ORF),全长为1662 bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K(赖氨酸)和121位的V(缬氨酸),符合基因VK型NDV特征;WF00C株有13个半胱氨酸(Cys)残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基;在限制性内切酶(RE)位点(nt334～1682)的分布上,3个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973 nt和1249 nt Rsa Ⅰ位点;WF00D株与WF00C株、WF00G株以及GenBank的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源性为84.7 %～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为88.4%～98.9%;3个分离株间的同源性较高,其与ZJ1、SF02和NA_1等鹅源毒株之间差异较小,而与LaSota、F48E9等毒株之间差异明显.根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型.     

猪细小病毒自然弱毒N株结构蛋白VP1基因的扩增及序列分析

设计两对引物,对广西分离的猪细小病毒自然弱毒N株(PPV-N株)结构蛋白VP1基因进行分段PCR扩增与测序,并与中国湖北、四川及加拿大、西班牙等地PPV毒株的VP1基因进行对比分析。结果表明这些毒株的VP1基因变异很小,发现存在有6个核苷酸高变位点。PPV-N株与加拿大NADL-2株的VP1基因的同源性最高,它们的核苷酸序列、推导的氨基酸序列的同源性分别为99.9%、99.6%,这为判断PPV-N株和NADL-2株均同属PPV弱毒株提供了分子生物学依据。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.