三株鹅细小病毒VP3基因的克隆和序列研究

为深入研究鹅细小病毒VP3基因的功能,利用PCR方法克隆了3株GPV分离株的VP3基因,并将其与pMD18-T载体连接,转化到感受态大肠秆菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析.结果表明:3株GPV VP3基因全长均为1 605 bp,编码534个氨基酸.不同毒株主要结构蛋白VP3基因与鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为93.8％～98.5％,但强弱毒株间也存在一定差异.     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2—VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对国内两株鹅细小病毒毒株（GPV CC株）和（GPV FS株）主要结构蛋白（VP2－VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体,分别获得正向，反向连接重组持粒PVPC1，PVPC2和PVPF1，PVPF2，经酶切鉴定选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV CC株和GPV FS株VP2－VP3的核苷酸大小分别为1764bp和1763bp，其中GPV CC株与A株同源性达到98．9％，GPV FS株缺失一个碱基，与A株同源性为93．5％，与GPV CC株同源性为93％。     

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPV H2分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后3－7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒，通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，经酶切鉴定后直接与pMD 18-T质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明；鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸，与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为98．5％，氨基酸序列同源性为98．3％，表明这二个毒株亲缘关系相近。     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

鹅细小病毒延边分离株VP3基因的克隆与序列分析

试验对鹅细小病毒延边分离株(YB株)VP3基因的克隆与序列进行了研究,并与GenBank上公布的国内外毒株VP3基因的核苷酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,为进一步研究鹅细小病毒的分子生物学特性和基因工程疫苗奠定了基础.     

鹅细小病毒VP3亚单位疫苗的制备及其免疫效果

为了研究鹅细小病毒(GPV) VP3亚单位疫苗的免疫效果,从ZJ-04分离株基因组DNA扩增VP1和VP3基因并克隆到pMD18-T载体,测定其核苷酸序列;将VP3基因亚克隆至质粒载体pET-32a(+),重组质粒pET-VP3用于转化E.coli BL-21(DE3)感受态细胞获得重组菌BL-VP3;以VP3重组蛋白和BL-VP3重组菌制备油乳剂疫苗免疫接种种鹅,用琼脂扩散试验检测血清GPV抗体,观察母源抗体对雏鹅GPV感染的免疫保护效果.结果表明,ZJ-04株VP1基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸,与Gen-Bank收录的GPV毒株的核苷酸序列同源性为95.3％～99.2％,氨基酸序列同源性为97.7％～99.3％;SDS-PAGE、Western blot检测结果表明,重组VP3分子质量约80 ku,能与GPV抗体发生特异性反应;VP3包涵体和BL-VP3重组菌均能诱导种鹅产生GPV抗体,新生雏鹅可获得良好的免疫保护.     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析术

摘 根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计1对引物，应用PCK技术扩增MDPVFS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上，MDPVFS株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，对插入片段进行序列测定。结果表明，我国分离的MDPVFS株基因序列与国外发表序列的同源性为98．6％，与已发表的YZ株同源性为99．5％，可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。     

鹅细小病毒JLDA株主要结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较

以分离得到的鹅细小病毒JLDA株基因组DNA为模扳，根据GPVB株的基因序列设计一对扩增GPV VP3基因的特异引物，利用PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，与pMD18 T simple vector连接，转化到感受态大肠杆菌DH5α中，提取重组质粒经PCR鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。分析结果：JLDA病毒株的VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。与国内外已经发表的鹅细小病毒Goose parvovirus virulent B strain，completegenome（vp3）、GDFSH株、QTH株、Gooseparvovirus capsid protein VP3 gene-YZ、SY株、GD-01株、SCH株和DY株的核苷酸、氨基酸序列同源性在90．90％～98．10％之间，表明这9个毒株之间同源性很高，有共同的保守序列，为开发新型基因疫苗提供依据。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠序列地高辛探针的制备和应用

根据GPV H1株核苷酸序列，设计了扩增VP1-VP3基因非重叠序列的1对引物，对其结构蛋白VP1与VP3非重叠核苷酸序列进行PCR扩增，将PCR产物纯化、回收后制备出GPV VP1-VP3基因DIG标记核酸探针，其标记效率达到0．1pg／μl。特异性检测结果表明，该探针能与GPV不同毒株核酸发生特异性杂交，而与对照的DPV、GPMV等病毒的核酸杂交反应均为阴性；敏感性检测结果表明该探针对GPV的最低检出量为0．032ng。上述试验结果表明该探针可以用于GPV感染临床病料的检测。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒 (MPV) FM株基因组核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,分别对国内 2株番鸭细小病毒分离株 MPV扬州 (YZ)株和 MPV佛山 (FS)株主要结构蛋白 (VP2和 VP3)基因进行 PCR扩增 ,并克隆到p CR3.1T载体 ,经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较。结果表明 ,MPV YZ和 MPV FS的VP2 - VP3基因大小均为 176 4bp,编码 5 88个氨基酸。 MPV YZ、MPV FS与 MPV FM核苷酸序列同源性分别为98.5 %和 98.6 % ,氨基酸序列同源性为 97.1%和 97.8% ;MPV YZ与 MPV FS核苷酸序列的同源性为 99.5 % ,氨基酸序列同源性为 98.8%。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

吉林地区1株小鹅瘟病毒NS1和VP1基因的克隆与序列分析

为了解吉林地区小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的基因特征,及其与黑龙江及中国其他省份和国外流行毒株的相关性,本研究采用PCR方法鉴定2018年吉林某养鹅场送检的病死雏鹅的肠组织,同时对GPV的非结构蛋白NS1基因及结构蛋白VP1基因进行了克隆和测序,并与国内外16株GPV参考毒株的相应序列进行分析。结果表明,病死雏鹅为GPV与减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）混合感染;吉林地区GPV的NS1基因长为1 884 bp,编码627个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.8%~99.8%,氨基酸序列同源性为97.1%~99.7%;VP1基因长为2 199 bp,编码732个氨基酸,与参考毒株核苷酸序列同源性为93.4%~99.9%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.9%。NS1及VP1基因的系统进化树分析均表明,吉林地区GPV与哈尔滨分离株98E属于同一进化分支,亲缘关系最近,与国外分离株、中国台湾和安徽分离株亲缘关系均较远。吉林地区GPV与鹅源GPV具有较近的亲源关系,同源性明显高于其他水禽来源的GPV。该研究为明确中国东北地区GPV空间的流行规律提供基础数据,为东北地区GPV的诊断与治疗提供参考依据。