传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

传染性法氏囊病病毒VP2-4-3 cDNA的分子克隆和序列分析

从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

IBDV流行强毒HQ-b株与其细胞适应毒生物学特性比较及VP2、VP5基因序列分析

为了解IBDV流行强毒HQ-b株囊毒与其细胞适应毒间生物学特性差异及2毒株毒力变化与VP2、VP5基因变异的关系,对2毒株的细胞适应性、致病性等进行比较,同时对其VP2、VP5基因序列进行分析。结果表明,HQ-b株囊毒对CEF、CEK、CELi、DF-1和Vero均不适应,而细胞适应毒HQ株仅不能适应Vero细胞、且批内及批间毒价稳定。致病性结果显示HQ-b株对4周龄SPF鸡致死率高达80%,是真正的超强毒,而细胞适应毒致死率已降为0%。对VP2基因高变区研究表明,HQ-b株具备IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S;其细胞适应毒HQ株除222A→P、256I→V、294I→L和299S→N外,在VP2公认的毒力位点253(Q→H)、279(D→N)、284(A→T)位氨基酸也发生改变,导致细胞适应毒具备经典弱毒株的分子特征,即222P、256V、279N、284T、294L和299N。对VP5基因研究表明:流行强毒HQ-b株也具有IBDV超强毒株的分子特征;其细胞适应毒VP5基因有12个位点碱基突变并导致9处氨基酸变异,尤其是ORF区第2个碱基由"T"突变为"C"后,导致细胞适应毒VP5的N端丢失了4个氨基酸,这种突变与现有的疫苗毒完全一致。本研究提供了超强毒HQ-b培育、驯化后致病性和细胞适应性转变的分子机理,也丰富了IBDV分子流行病学的理论。     

安徽地区IBDV超强毒株的分离鉴定和VP2基因序列分析

经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、易感鸡接种试验、电镜观察,从安徽地区疑似病鸡的法氏囊组织分离到3株传染性法氏囊病毒。分离株人工感染4周龄鸡,致死率分别为92%、83%、67%。接种9～10SPF鸡胚测得的鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2mL、10-5.4/0.2mL、10-4.6/0.2mL。应用Nested-PCR分别对3株分离株VP2基因高变区进行克隆测序和序列分析,结果表明:3个分离株与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为97.2%～99.5%,氨基酸同源性为99.3%～100%,VP2高变区核苷酸和推导的氨基酸符合传染性法氏囊病病毒超强毒株特征。     

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）,采用RT—PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89．5％～98．9％之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98．9％;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98．2％～99．5％之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。     

Molecular characterization and phylogenetic analysis of infectious bursal disease viruses isolated from chicken in South China in 2011

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a double-stranded RNA virus that causes immunosuppressive disease in young chickens. Thousands of cases of IBDV infection are reported each year in South China, and these infections can result in considerable economic losses to the poultry industry. To monitor variations of the virus during the outbreaks, 30 IBDVs were identified from vaccinated chicken flocks from nine provinces in South China in 2011. VP2 fragments from different virus strains were sequenced and analyzed by comparison with the published sequences of IBDV strains from China and around the world. Phylogenetic analysis of hypervariable regions of the VP2 (vVP2) gene showed that 29 of the isolates were very virulent (vv) IBDVs, and were closely related to vvIBDV strains from Europe and Asia. Alignment analysis of the deduced amino acid (aa) sequences of vVP2 showed the 29 vv isolates had high uniformity, indicated low variability and slow evolution of the virus. The non-vvIBDV isolate JX2-11 was associated with higher than expected mortality, and had high deduced aa sequence similarity (99.2 %) with the attenuated vaccine strain B87 (BJ). The present study has demonstrated the continued circulation of IBDV strains in South China, and emphasizes the importance of reinforcing IBDV surveillance.     

一株鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定

从天津地区免疫失败的鸡群中分离一株IBDV(命名TJ-hg),应用血清学AGP试验结果可见明显的白色沉淀线;应用逆转录酶—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的 IBDV VP2 基因高变区(vVP2)及其序列分析的结果表明,TJ-hg株与超强毒株的核苷酸同源性均在90%以上,氨基酸同源性达98.8%~99.3%,且高变区中特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,TJ-hg株在第一亲水区氨基酸Q219P发生突变。研究结果表明,TJ-hg株属于超强毒株,但又与标准毒株存在差异。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区序列分析

根据传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２基因ＣＤＮＡ序列,在ＶＰ２基因高变区设计一对引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＩＢＤＶ分离株ＪＳ３和ＪＳ４。将扩增片段克隆后以双脱氧链末端终止法测定核苷酸旬。ＪＳ３和ＪＳ４的同源性最高达９８％。与已发表的ｖｖＩＢＤＶ,ＩＢＤＶ变异要ＢＤＶ经典株为ＩＢＤＶ弱毒株核苷酸序列的同尖拨天９２￣９８％之间,根据ＩＢＤＶ的大ＯＲＦ推导出该片段蛋白的氨基酸序更,ＪＳ３和ＪＳ４的     

Changes in VP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China

Very virulent (vv) infectious bursal disease virus (IBDV) Gx strain with high pathogenicity was attenuated through replication in specific-pathogen-free (SPF) chicken embryos and in chicken embryo fibroblast (CEF) cell cultures. The changes in VP2 nucleotide and the deduced amino acid sequences were obtained during attenuation of vvIBDV in CEF culture. Sequence analysis of selected passages from numbers 0 to 20 in CEFs (designated here Gx to CEF-20) showed that no changes were detectable in the VP2 gene before CEF-7. There were a few changes in the nucleotide sequence of the VP2 gene but no amino acid substitutions at CEF-8. The virus of CEF-9 was an intermediate with some amino acid changes that possibly were related to virulence. CEF-10 virus had become similar to CU-1 strain. The VP2 gene sequence remained the same from CEF-10 to CEF-20. The results of pathogenicity tests showed that the mortalities of Gx, CEF-5, CEF-8, and CEF-9 in 4-wk-old SPF chickens were 64%, 60%, 60%, and 32%, respectively; whereas CEF-10, CEF-15, and CEF-20 were nonpathogenic. Virus neutralization tests with Gx strain showed that the antigenicities are similar from Gx to CEF-20.