抗虫转CpTI基因植物定性PCR检测技术的建立

为建立CpTI基因定性PCR检测方法,通过数据库查询和测序获得CpTI基因序列,设计特异性定性PCR引物,对引物、PCR反应条件和反应体系进行优化,并对检测方法的特异性、灵敏度等进行分析试验。结果表明,CpTI基因特异性定性PCR检测方法选择退火温度为58℃,引物浓度为0.4μmol/L较好,该方法能够特异性检测样品中CpTI基因,检测灵敏度达0.05%(质量比)。该方法符合农业转基因生物产品成分检测标准对特异性、灵敏度、重复性的要求,可为抗虫转CpTI基因植物生物安全管理提供技术支撑。     

核酸免疫制备豇豆胰蛋白酶抑制剂抗体的制备及初步应用

通过构建pcDNA3．1-CpTI真核表达载体，肌肉注射免疫Balb／c纯系小鼠，获得特异性的核酸免疫CpTI抗体，其效价达1：800，所获抗体可与纯化的CpTI蛋白发生特异性反应，检测OD406值和包被蛋白量相关系数为0．9961；间接法测定转cpti基因水稻结果表明，核酸免疫制备的抗体能与转基因水CpTI蛋白产生特异性反应，可用于转基因水稻cpti基因表达的定性测定。     

一种DNA提取新方法在转基因水稻种子检测中的应用

将水稻种子打磨成粉,取100 mg粉末加入SDS和NaC1等试剂配制成高盐提取液,然后提取基因组DNA.超微量分光光度计NanoDrop 1000检测及Eco RV酶切反应的结果表明,该方法比CTAB法的DNA浓度更高、纯度更好.以提取得到的DNA为模板,采用PCR法分别对水稻特异性内源基因SPS及转基因水稻外源基因Bt进行扩增,均能扩增到清晰的目标条带.这种DNA提取新方法不仅简单快速、成本低廉,而且提取到的DNA质量高,扩增效果好,可有效地用于水稻种子转基因成分的检测.     

一种用于转基因水稻快速检测的DNA提取方法

[目的]建立一种快速筛选转基因水稻的DNA提取方法。[方法]对试剂盒法和快速法2种DNA提取方法进行比较,并分别用转Ta NADP-ME1和Ta NADP-ME2基因的转基因水稻进行验证。[结果]用快速法提取得到的DNA进行PCR扩增,可分别得到约1 700 bp的Ta NADP-ME2基因和约1 900 bp的Ta NADP-ME1基因,且条带清晰明亮,与试剂盒法相比无显著差异。[结论]该研究中快速提取DNA的方法经济、简便、快捷,适合用于对大量转基因样品进行检测。     

抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。     

食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立

[目的]建立FMV35S基因启动子环介导等温扩增的检测方法.[方法]建立一种检测食品和饲料中FMV35S转基因成分的环介导恒温扩增（LAMP）检测方法,并利用实时浊度法对该LAMP检测方法进行灵敏度、特异性和稳定性评价.[结果]该方法的检测限为0.5％,特异性和稳定性良好.采用LAMP法与荧光PCR方法进行了实际样品对比检测,结果一致可靠.[结论]可采用LAMP法对食品和饲料中FMV35S转基因成分进行检测.     

抗CMV转基因辣椒实时荧光PCR检测方法研究

针对辣椒中转基因成分建立快速、高效、准确的实时荧光PCR检测方法,以缩短检测周期,提高检出率。结果表明,针对转基因辣椒的内源基因CaATL1和外源基因CMV建立的检测方法,具有很好的特异性,二者检测灵敏度均可达0.01%。本研究建立的检测方法特异性、灵敏度和准确度高,也比较方便快速,同时使用的是全部闭管操作,大大降低了普通PCR带来的污染,为转基因辣椒的检测提供了新的检验方法。     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。     

转基因大豆及其深加工产品的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了从大豆及其深加工产品中检测转基因成分的方法。大豆及其深加工产品采用改良的CTAB法进行DNA提取纯化,大豆色拉油DNA则用试剂盒方法进行了提取纯化。对提取的DNA用PCR方法对大豆特异性内源基因lectin进行扩增,设计CaMV35启动子和NOS终止子特异性引物对其是否含有转基因成份进行初步的定性PCR筛选,并用抗除草剂基因CP4EPSPS对阳性结果进行确证。实验结果表明,改良的CTAB法对大豆深加工产品的DNA有很好的提取效果,而试剂盒方法对色拉油的DNA有良好的提取效果;PCR检测转基因的方法快速高效,检测结果与标准相符。     

基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测肉制品中鸭源性成分研究

本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）(TaqMan—LAMP)检测方法,用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物,优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度试验;同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法 实时荧光PCR法》作比较,对市售肉制品进行检测,验证本方法的准确性。所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强,仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线,30 min内完成检测,灵敏度为0.001%(w/w),重复性好,批次内变异系数CV为1.99%,对47份肉制品进行检测,检测结果与国标法相比,相对敏感性、特异性和符合率均为100%。本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。     

RNAi转基因大豆品系‘B5C9123-5’的RPA可视化检测技术

为开发RNAi转基因作物的田间可视化鉴定方法,以DNA嵌合染料SYBR Green I为材料,采用设置重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)特异性引物的手段,建立了一种快速、低成本、可视化的RPA用于转基因大豆‘B5C9123-5’的检测。结果表明,在靶标不存在时,RPA体系中游离的SYBR Green I染料使溶液呈现较弱的黄色荧光。在靶标存在的情况下,RPA扩增产生的双链DNA与SYBR Green I结合导致溶液从黄色转变为绿色并使荧光迅速增强。通过对RPA扩增时间和温度进行优化,阳性结果可在20 min内用肉眼鉴别,检测限为1.00 ng/μL。通过设置不同RPA引物,该方法可用于现场快速检测多种RNAi转基因作物。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

食用酱油中曲霉的检测方法

为了快速检测酱油中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素产生菌的污染,利用现代分子技术并结合曲霉菌的一些菌落与孢子特征差异,建立了曲霉菌快速检测方法。结果表明,使用黑曲霉钙调蛋白基因所设计的黑曲霉特异性引物,能够将黑曲霉与其他曲霉分离,黑曲霉中可以扩增出钙调蛋白基因特异性片段,而在米曲霉和黄曲霉中不能扩增到该基因片段。利用aflR等多个已知基因设计特异性引物,扩增结果表明,米曲霉和黄曲霉的菌株并无特异性条带差异。但是,黄曲霉与米曲霉的菌落特征及孢子特征差异显著。由此建立的以PCR检测结合菌株培养特征区分多种曲霉的方法,可以用于检测酱油中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素产生菌的污染。     

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测 转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。     

农作物中Cry1A(c)和CP4-EPSPS转基因成分双重实时荧光PCR检测方法的建立

采用羧基荧光素(FAM)和六氯荧光素(HEX)荧光基团标记探针,建立针对农作物中常见抗虫和抗除草剂基因的双重实时荧光PCR检测方法,通过特异性、检出限以及模拟掺假试验验证此方法在转基因检测中的适用性.特异性检测试验中仅转基因作物(转基因棉花、转基因水稻、转基因大豆)和阳性质粒检测出相应转基因成分,其余样品均未出现明显P...     

PCR法快速检测扩张青霉

 【目的】研究棒曲霉素扩张青霉菌（Penicillium expansum）的快速和特异性PCR检测方法。【方法】通过P.expansum的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,以基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase编码基因的两对引物扩增P.expansum DNA,建立特异和快速的检测P.expansum的方法。【结果】基于polygatacturonase基因的引物具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6 μｇDNA/每反应体系,整个检测时间约为5 h,比传统培养法（4～6 d）时间大大缩短。苹果、苹果果肉和果汁接种纯P.expansum后所提DNA都得到了很好的扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰。【结论】本研究建立的P.expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中P.expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对P.expansum污染的快速溯源。     

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。