农业转基因成分检测能力验证工作的关键点分析

能力验证是加强转基因检测机构能力水平和质量控制的重要措施。本文介绍了能力验证的概念和意义,以及农业部科技发展中心多年组织开展农业转基因成分检测能力验证工作的经验,包含实施方案确定、样品制备、结果分析过程中的关键点和注意事项,并对照当前能力验证工作存在的问题,提出了进一步完善的建议,以期对今后的能力验证工作提供参考。     

贝母属植物叶绿体基因组候选SNP位点应用分析

贝母属植物是中国中药材的宝库,由于形态上难以区分,在民间应用、临床应用和中药市场中还存在混淆应用、以次充好的现象,急需开发基于新型分子标记位点的精准检测方法。本研究应用多重序列比对、SNP筛选等生物信息学分析手段,对贝母属15种植物28条叶绿体基因组序列进行分析。结果发现,贝母属叶绿体基因组DNA同源性达97.22%,通过分析共发现SNP位点5879个,其中川贝母类鉴别候选位点71个,川贝母鉴别候选位点4个,瓦布贝母鉴别候选位点37个,太白贝母鉴别候选位点147个,浙贝母鉴别候选位点91个,湖北贝母鉴别候选位点271个,平贝母鉴别候选位点1393个,伊贝母鉴别候选位点89个。本研究还对SNP位点在精准鉴定、精确定量应用方面进行了讨论,可为川贝母中药资源鉴定提供技术支撑。     

腐烂葡萄中微生物多样性及真菌毒素测定分析

以天津、北京、杭州等10个地区的葡萄园以及市场中的75份腐烂葡萄为研究对象，应用分子生物学手段进行葡萄表面微生物（细菌和真菌）多样性的核酸测序（包括16S区域扩增子和ITS区域扩增子）分析；同时基于次级代谢产物，使用高效液相色谱（HPLC）法对葡萄样本进行了21种真菌毒素的测定分析，以初步摸清主要风险危害，锁定风险菌株。结果表明，对表面微生物的核酸测序共获得细菌16S有效OTU信息732个和真菌ITS有效OTU信息4 336个，构建了葡萄表面菌相分子数据库，其中包括367种细菌和256种真菌，其主要病原菌为青霉、黑曲、链格孢菌、杂色曲霉、灰葡萄孢、炭疽和盾壳霉；通过真菌毒素测定分析，共检测出4种真菌毒素，分别为交链孢毒素AOH、交链孢毒素AME、交链孢毒素TeA和交链孢毒素TEN。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象，利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物，利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h，通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物，其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致，灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性，结果可靠，非常适合转基因作物的快速检测，有较好的应用价值。     

LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用

以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测.     

利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。     

真菌RNA沉默研究进展

阻抑(Quelling)与减数分裂沉默(Meiotic silencing by unpaired DNA,MSUD)等真菌RNA沉默(RNA silencing)现象的研究拓展了我们当前对基因表达调控的认知。随着测序信息量的爆炸性增长与功能研究的不断深入,真菌RNA沉默展示出的复杂与多样为真核生物研究提供了全新的视角。本文就当前真菌RNA沉默及相关小分子RNA(Small RNA,sRNA)的研究现状做一简要概述。     

抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。     

基于SNP标记的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

根据国际葫芦科基因组数据库CuGenDB中序列信息,应用高分辨率熔解曲线技术筛选出用于黄瓜杂交种纯度鉴定的SNP位点CLA6（A/G）,该位点在33个市售黄瓜品种中的多态信息量为0.401,处于中度多态|结合焦磷酸测序技术,建立基于CLA6位点的SNP-Pyrosequencing黄瓜杂交种纯度鉴定方法。利用该鉴定方法检测黄瓜杂交种优一90粒种子,结果其种子纯度为96.7%,该结果与CLA0位点及SSR鉴定结果相符,表明该鉴定技术适于黄瓜杂交种纯度鉴定,具有用于DUS测试分析的潜力。