用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

RNAi转基因大豆品系‘B5C9123-5’的RPA可视化检测技术

为开发RNAi转基因作物的田间可视化鉴定方法,以DNA嵌合染料SYBR Green I为材料,采用设置重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)特异性引物的手段,建立了一种快速、低成本、可视化的RPA用于转基因大豆‘B5C9123-5’的检测。结果表明,在靶标不存在时,RPA体系中游离的SYBR Green I染料使溶液呈现较弱的黄色荧光。在靶标存在的情况下,RPA扩增产生的双链DNA与SYBR Green I结合导致溶液从黄色转变为绿色并使荧光迅速增强。通过对RPA扩增时间和温度进行优化,阳性结果可在20 min内用肉眼鉴别,检测限为1.00 ng/μL。通过设置不同RPA引物,该方法可用于现场快速检测多种RNAi转基因作物。     

多重PCR检测耐除草剂转基因作物

为建立耐除草剂转基因作物的高通量检测方法,本试验以目前生产上广泛应用的5种除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar和aad1为靶标进行多重PCR(MPCR)研究。通过引物适用性测试、反应体系中的不同引物浓度和反应程序中的退火温度测试、灵敏度和特异性验证等,建立了能同时检测5种除草剂抗性基因的MPCR检测方法。结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1基因的检测引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2μmol·L^-1,退火温度为63℃时5种靶标扩增效果较好,且特异性条带清晰且均一。此外,MPCR检测方法具有较好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度均可达到0.1%。适用性测试结果显示,MPCR检测方法可对含有5种除草剂抗性基因的多种转基因作物的单个品系或多个品系混合物进行筛选检测。无假阳性和假阴性结果表明,MPCR检测方法对实际样品具有很好的适用性。本试验结果为筛选高效耐除草剂转基因作物检测技术提供了一定的理论依据。     

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因和pat基因覆盖了21种玉米转基因转化体。通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件及zSSIIb内源基因的五重荧光PCR和基于转化体特异性序列的二重荧光PCR检测转基因成分方法体系。方法参数测定结果表明,此方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度达到0.05%。同时,此方法体系不仅适用于转基因玉米成分筛查,对大豆、水稻等多种作物进行转基因成分筛选鉴定也有良好的适用性。     

转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

基于突变体库的转基因作物安全评价问题解析

突变体是功能基因组学研究的重要材料,突变体库的构建是大规模分离和鉴定新基因的必要手段,是进一步开发优良转基因品种(系)的基础。根据农业转基因生物的定义,利用生物技术获得的突变体也是转基因生物,突变体材料的田间筛选应遵循转基因生物安全管理法律法规的要求。文章从农业转基因生物安全管理的角度论述了针对这类突变体材料的安全评价问题。     

转基因大豆MON89788检测质粒标准分子的构建与应用

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子。[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3′端特异性序列和5′端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证。[结果]获得了3700bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1029bp。该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10copy。[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代MON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测。     

转基因大豆MON89788检测质粒标准分子构建与应用

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子.[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3'端特异性序列和5'端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证.[结果]获得了3 700 bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1 029 bp.该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10 copy.[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代NON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测. Abstract： [Objective] The aim was to construct a plasmid reference molecule (PRM) for detection of transgenic soybean MON89788.[Method]the lectin gene sequence,3'-junction and 5'-junction sequence between host plant DNA integrated DNA of MON89788 soybean were amplified independently,and the three fragments were cloned into the cloning vector pMD18-T in order through molecular manipulation method to construct pMD-LM3M5,the applicability of the constructed novel PRM was tested. [Result] Sequencing confirmation result showed that the PRM was 3 700 bp in length,containing 1 029 bp of recombined DNA fragment.The limits of qualitative detection of the PRM were 10 copies,[Conclusion]The PRM constructed in this study was suitable for the identification of MON89788 event.     

抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究

根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。