有齿食道口线虫ITS及5.8S DNA片段的PCR扩增、克隆及序列分析

 运用PCR方法以保守引物NC5及NC2扩增了从广东阳江地区猪体分离的食道口线虫rDNA 的内转录间隔区（ITS）及5.8S序列。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明，扩增的片段大小为828 bp，包含部分的18S、28S及全部的ITS-1（362 bp）、5.8S(153 bp)及ITS-2（217 bp）序列。序列比较表明，该食道口线虫为有齿食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪有齿食道口线虫的ITS及5.8S序列，为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

三七病原根结线虫核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用

根据NCBI基因库中根结线虫属rDNA序列,设计通用引物M18s/M28s,对采自云南文山、砚山、马关、蒙自等地的4个三七病原根结线虫种群(Meloidogyne hapla)rDNA区段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,并将扩增到的目的片段克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行测序和序列分析,结果表明:4个种群rDNA同源性为100%,ITS区序列长度为479 bp,其中ITS1序列长度为213 bp,5.8S序列长度为159 bp,ITS2序列长度为107 bp。根据此序列设计-对特异性寡聚核苷酸引物Mhf/Mhr,应用PCR技术,以北方根结线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)和爪哇根结线虫(Meloido-gyne javanica)全基因组DNA为对照,对三七病原根结线虫全基因组DNA进行特异性扩增。结果表明,该对引物能从供试的北方根结线虫和三七病原根结线虫种群全基因组DNA中扩增到462 bp长度的分子片段,而南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫则无扩增产物。该引物可用于三七病原根结线虫的检测。     

进境黄盖鲽鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以俄罗斯进境的冻黄盖鲽鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2 PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,并进行克隆,转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为1 034 bp。包含部分的18S、28S及全部的ITS1(431 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(349 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank已登记的Hysterothylacium aduncum同源性均在99.5%以上,与其他科线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从黄盖鲽鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与H.aduncum处于同一分支。研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

黄鳝胃瘤线虫线粒体cox1基因的多态性研究

为了解渝西地区黄鳝胃瘤线虫分离株线粒体细胞色素C氧化酶第I亚基(cox1)的遗传变异情况及与其他科线虫的种群遗传关系,本研究对该地区黄鳝胃瘤线虫cox1部分序列进行了克隆测序和进化分析.结果表明渝西地区6株胃瘤线虫分离株的cox1序列长度一致,均为441bp;各分离株之间的相似性为97.5%~100%.种系发育树表明,6个胃瘤线虫分离株均位于同一分枝.由于胃瘤线虫cox1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记.本研究结果为胃瘤线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析

以采自广东省佛山市的鸽蛔虫(Ascaridia columbae)为研究对象,利用保守引物BD1和BD2扩增鸽蛔虫基因组DNA的ITS rDNA片段,对扩增产物进行克隆和序列测定。结果成功扩增出大小为1045bp的ITS rDNA序列。获得的鸽蛔虫的ITS rDNA序列(AC001、AC002)的5.8S rDNA与GenBank收录的鸡蛔虫5.8S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001508)相似性分别为95.5%和94.3%,而与澳大利亚鸽蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001509)相似性分别为96.8%和95.5%。将获得的序列与蛔目不同科的代表性蛔虫的5.8SrDNA序列进行比对和系统进化分析,结果表明鸽蛔虫与鸡蛔虫处于同一进化分支上,也表明ITS rDNA是蛔虫分子鉴定的有效遗传标记,这对蛔虫分子分类学及分子流行病学的进一步研究打下了基础。     

中国不同地区杜仲rDNA的ITS序列分析

运用克隆测序法,对分布于中国不同地区的杜仲(Eucommia ulmoides)的核糖体DNA的ITS区(包括ITS-1,5.8S和ITS-2)进行测定.结果表明,杜仲植物的ITS区序列总长度为587-589 bp,长度变异仅为2 bp,其中ITS-1区为218～219 bp,在ITS-2区为205～206 bp,5.8SrDNA均为164bp,且高度保守,无变异位点.采用DNASTAR软件进行系统发育分析表明,来自不同地区的杜仲样品同源性均在96.9以上.根据ITS序列特征构建的系统树,来自同一地区的样     

海南黑山羊鞭虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

采用寄生线虫通用引物NC5和NC2,对海南黑山羊鞭虫rDNA的ITS序列进行PCR扩增,将扩增片段纯化后克隆至pEASY-T1载体。用PCR及酶切进行鉴定,对阳性菌落质粒DNA进行测序分析。结果表明,扩增的黑山羊鞭虫ITS片段大小为1 113 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(470 bp)、5.8S(158bp)和ITS2(392 bp)序列,ITS1和ITS2与GenBank已登录的Trichuris skrjabini(Baskakov)同源性分别达到90%和99%,与T.leporis(Froelich)同源性均为84%,而与其他科线虫同源性均较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从海南黑山羊盲肠中分离到的鞭虫ITS1和ITS2均与T.skrjabini处于同一分支。研究结果为海南黑山羊盲肠鞭虫种属的确定及进一步分子生物学研究奠定基础。     

基于ITS序列探讨新疆石竹属植物的系统发育

[目的]探讨新疆野生石竹的系统发育和种间亲缘关系.[方法]采用CTAB+硅珠法提取总DNA, 并对nrDNA的ITS区(包括ITS-1,5.8S rDNA和ITS-2)进行了序列测定.采用邻位相接法(NJ)和最大简约法(MP)进行聚类分析.[结果]新疆石竹属植物的ITS序列总长度为610～614 bp,ITS-1和ITS-2序列长度为235～238 bp和214～215 bp.5.8 S序列很保守,长度均为161 bp.在整个ITS序列中,共有119个变异位点,17个信息位点,分别占整个ITS序列长度的19.71; 和2.77;.[结论]齿瓣组和纟 遂瓣组分别聚成一支构成姊妹群,其支持率分别为90;和98;.并对种间亲缘关系进行了分析.     

毒麦属6个种的rDNA ITS序列测定及分析

提取毒麦属6个种的样品DNA,分别采用PCR产物直接测序和克隆测序2种方法,对毒麦属6个种rDNA的ITS区(包括ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2)进行序列测定.结果表明,毒麦属植物ITS序列总长度约为647 bp,其中ITS-1,5.8 S rDNA和ITS-2分别有16、7和7个变异位点.采用NJ法建立的系统发育树与形态学分类基本相符.     

首次测得蝴蝶兰基腐病菌rDNA ITS区序列

用White et al．于1990年设计的引物ITS4和ITS5对蝴蝶兰基腐病菌(Fusarium spp．)的rDNA ITS区片段进行了PCR扩增,并将扩增产物克隆到大肠杆菌JM109中进行测序,测得的序列长度为565bp。该序列的测得为蝴蝶兰基腐病菌的诊断提供了有利证据。     

卡氏住白细胞虫rDNA ITS-2的POR扩增与测序

运用PCR方法扩增了卡氏住白细胞虫rDNA的ITS-2及部分5．8S和28S序列(ITS2 )，并对该序列进行了克隆和测序。采用巨型裂殖体为材料，并根据Saccharomyces cerevisiae rDNA中的5．8S、28S保守序列所设计的通用引物ITS3、ITS4，进行了虫体ITS2 的PCR扩增，将所扩增片段纯化后成功地克隆于pGEM-T easy和PMDl8-T载体的T-T窗口。经双向自动测序显示，该ITS2 片段的大小为270bp；经NCBI Blast联机检索，结果显示，所扩片段中5．8S序列与S．cerevisiae的5．8S序列有部分相同，而ITS-2序列为虫体所特有；同时经wDNA-SIS软件分析，显示该ITS-2序列与S．cerevisiae间同源性相对较远，而与柔嫩艾美耳球虫间同源性相对较近，故而本试验中所测序列为卡氏住白细胞虫的ITS-2特有序列。     

斑石鲷卵鞭虫病病原的分子鉴定与系统发育分析

[目的]对严重危害斑石鲷鱼苗的卵鞭虫病病原——渤海分离株(Bohai-1407 isolate)进行分子生物学鉴定和系统发育分析。[方法]设计4对特异性引物,应用PCR方法克隆并测定渤海分离株的核糖体DNA(rDNA)序列;应用Blast比对分析渤海分离株rDNA的结构;依据rDNA序列,分别构建10种胚沟科鞭毛虫和19株眼点淀粉卵涡鞭虫分离株/克隆的系统发育树,分析渤海分离株的系统分类地位。[结果]扩增出了渤海分离株的4个DNA片段,拼接出长度为6 530 bp的r DNA操纵子序列;该操纵子由74 bp的部分外转录间隔区(ETS)、1 813 bp的小亚基(SSU)、352 bp的内转录间隔区1(ITS1)、159 bp的5.8S、698 bp的内转录间隔区2(ITS2)和3 388 bp的大亚基(LSU)串联而成,3'端还有46 bp的部分非转录间隔区(NTS);渤海分离株与眼点淀粉卵涡鞭虫宁德株(Ningde1412)的rDNA序列相似性高达99.5%;依据SSU序列建立了包含10种胚沟科鞭毛虫的系统发育树,渤海分离株与世界各地分离到的眼点淀粉卵涡鞭虫聚类在一起,将其鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫;依据ITS1和ITS2序列建立了包含19株眼点淀粉卵涡鞭虫的2个系统发育树,渤海分离株与从美国弗罗里达盐水池塘中分离到的墨西哥湾分离株FL_21(DQ490260.1)总是聚类在一起。[结论]斑石鲷卵鞭虫病的病原——渤海分离株可以鉴定为眼点淀粉卵涡鞭虫,该分离株与墨西哥湾分离株FL_21的亲缘关系最近。     

不同产区麦冬、山麦冬rDNA-ITS序列分析

利用特异性引物进行PCR扩增和克隆、测定不同产区麦冬和山麦冬原植物的18S～26S r DNA-ITS区碱基序列,结果得到供试的7个不同产区麦冬和山麦冬植株样品rDNA的ITS及5.8S rDNA全序列、18S和26S rDNA部分序列,序列长度在696～711 bp.通过分析比较各ITS序列,表明不同产区麦冬和山麦冬rDNA-ITS区存在差异,可为其分子鉴别提供了依据.     

栉江珧核糖体转录间隔区的初步研究

[目的]对栉江珧的核糖体转录间隔区(ITS)序列进行分析研究。[方法]利用特定引物对栉江珧(Atrina pectinta)转录间隔区ITS-1和ITS-2的序列片段进行PCR扩增及测序,并分析片段的碱基序列特征。[结果]栉江珧ITS-1序列长度为570 bp(含20.2%T、30.0%C、22.3%A、27.5%G)、ITS-2长度为618 bp(含22.3%T、27.3%C、23.5%A、26.9%G);与魁蚶、栉孔扇贝、牡蛎、菲律宾蛤仔进行比对,栉江珧ITS-1的相似性在25.6%～38.1%之间,ITS-2的则在24.5%～38.9%之间,说明栉江珧与试验所选的4种贝类之间的进化关系较远,种间变异很大,ITS序列可用于该纲物种的分类及鉴别。[结论]该研究为我国栉江珧的种质资源保护和利用提供了一定的分子生物学依据和参考。     

腐烂茎线虫种内群体特异性检测研究

对腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne)7个不同地理群体rDNA 中的ITS区进行PCR-RFLP和序列测定, 发现种内群体间无论在序列长度还是酶切图谱均存在一定的变异.根据其序列特征设计出种特异性引物, 对所供试的腐烂茎线虫群体及属间不同种群体样品的rDNA ITS区相应区段扩增以验证其特异性, 同时对分别由1～5条腐烂茎线虫成虫和幼虫提取的DNA进行特异性扩增以验证其灵敏度. 结果表明: 所有供试的腐烂茎线虫群体均可以特异性扩增一个346 bp的片段, 而所有供试的属外种均没有扩增片段;由1～5条腐烂茎线虫成虫和4～5条幼虫进行的特异性扩增也获得稳定的目的片段. 显示该特异性引物具有较高的稳定性、特异性和灵敏度, 能快速、准确地检测出腐烂茎线虫.     

甜橙核糖体DNAITS序列分析

以18个甜橙品种为材料,采用克隆测序法对其核糖体 DNAITS进行序列测定,并用 DNAStar软件进行序列分析.结果显示,甜橙ITS序列的长度为693~694bp,其中ITS1长272bp,5.8S长度为164bp,ITS2长度为257~258bp.甜橙品种间ITS序列的相似性较高,相似率为97.7%~100%.同时发现18个甜橙品种ITS序列中存在20个碱基变异位点,其中ITS1和ITS2序列中各含10个,而5.8S序列中没有碱基变异.根据这些碱基变异位点可鉴别出供试材料中的12个甜橙品种.     

华南虎绦虫ITS及5.8S rDNA序列扩增与序列分析

以从广州动物园华南虎体内采集的2条绦虫作为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物BD1和BD2对提取的DNA进行PCR扩增,经胶回收纯化后,连接到pGEM-T Easy载体上,然后转化并鉴定出阳性菌落,对菌落进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank公布的相关绦虫ITS序列进行对比分析,结果显示,采自广州动物园华南虎的2条绦虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为1387bp,序列相似性为100%,与猬迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、舌形属绦虫(Diphyllobothrium ligula)、宽节双叶槽绦虫(Diphyllobothriumlatum)的ITS及5.8S rDNA序列相似性分别为96.7%、66.5%、71.5%,结果显示,此次分离的绦虫属于迭宫属的猬迭宫绦虫,所测得的华南虎猬迭宫绦虫的ITS序列为首次报道。     

肾形肾状线虫个体间rDNA内转录间隔区的变异

利用DNA序列分析技术对我国浙江、福建和重庆3个地区的肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis,RN)种内群体及群体内个体间核糖体RNA基因(rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行PCR扩增及序列变异分析。结果显示不同的群体间均获得2种PCR产物,标记为变异类型Ⅰ(RN_VAR1)和变异类型Ⅱ(RN_VAR2)。基于每个群体内2条雌虫分别挑取各变异类型的5个克隆测序,共得到60个克隆序列。经序列比对分析,发现肾形肾状线虫rDNA基因2种类型的ITS区变异很大,其中变异类型Ⅰ序列长度为705~712bp,鸟嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine content,GC)含量为45.1%~46.7%;变异类型Ⅱ序列长度为854~860bp,GC含量为48.4%~50.0%。2种类型的ITS相似度(包括5.8SRNA基因)仅为62.1%~65.6%,而各rDNA变异类型内部各个克隆序列也存在差异,变异类型Ⅰ内个体间相似度为89.9%~100%;变异类型Ⅱ内个体间相似度为91.4%~99.8%。系统进化分析表明2种变异序列明显分成2支,同时通过ITS序列分析无法将3个地方群体区分开来。经实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测发现RN_VAR1含量稍大于RN_VAR2,分别占保守18S基因的rDNA重复单位含量的56%和40%。同时,还发现肾形肾状线虫的2种rDNA-ITS变异类型与已报道的2种18SRNA基因变异类型相对应,表明肾形肾状线虫存在2种rDNA变异类型。     

狮体内蛔虫的分子生物学鉴定

对采自哈尔滨北方森林动物园美洲狮体内蛔虫进行分子生物学鉴定。首先提取狮体内蛔虫基因组DNA,以特异性引物扩增虫体核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列并进行测序,然后与其他蛔科线虫比对,分析亲缘关系。结果显示狮体内蛔虫ITS及5.8S rDNA序列总长为925 bp,其中ITS1序列长为423 bp,5.8S序列长为157 bp,ITS2序列长为345 bp。与狮弓蛔虫、犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和犊弓首蛔虫间的同源性分别为96%,70.7%,70.7%,75.2%,因此鉴定该虫为狮弓蛔虫。     

核rDNA ITS序列在植物种质资源鉴定中的应用

核rDNA 的内转录间隔区ITS序列包含被5.8S rDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段.在裸子植物中,ITS序列长度变异较大,不利于扩增和测序,但长度的变异可以作为一个性状用于裸子植物的鉴定与系统学研究.在被子植物中,ITS序列的长度稳定,而且序列变异较快,可以提供丰富的信息位点,是被子植物鉴定中的重要分子标记.文中对ITS在植物物种鉴定中的应用进行了介绍.