巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

基于ITS序列大豆茎褐腐病菌的PCR鉴定

提取了分别来自11个种共13株真菌(都是大豆上的常见病害的病原菌)的DNA.采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增,并对大豆茎褐腐病菌的PCR产物进行测序.根据所得大豆茎褐腐病菌与其常见易混淆品所在属在ITS区的基因序列比较分析,设计并合成了1对特异性引物.采用此对引物,只有大豆茎褐腐病菌能扩增出500 bp条带,检测的灵敏度达到4.2 pg/μL.将此对引物应用于人工接种大豆茎褐腐病菌大豆的检测,结果表明,此方法能够成功区分大豆茎褐腐病菌及其近似种.     

进境风信子种球中菊基腐病菌的鉴定

从荷兰进境风信子种球带有典型软腐症状的样品上分离到1株细菌分离物5093-1,对该分离物进行菌落形态特征观察、致病性测定、过敏性反应测定、16S序列分析和Biolog测试。结果表明:该分离物人工接种风信子种苗、马铃薯薯块和蝴蝶兰均能引起腐烂反应,也能引起烟草过敏性坏死反应,16S序列和菊基腐病菌的序列相似性为99.6%,Biolog测试结果为菊基腐病菌。根据试验结果将分离物5093-1鉴定为菊基腐病菌。     

辽宁地区辣椒疫病菌鉴定及同源性分析

对采集到的辣椒疫病病原菌通过形态学观察和rDNA-ITS序列分析进行鉴定及同源性研究。利用真菌通用引物ITS4、ITS5对病菌基因组进行PCR扩增,将测序结果与已知序列进行比对,并利用Clustalx1.83及MEGA4.0软件进行聚类分析。试验结果表明:病菌菌落为白色,菌丝呈鹅毛绒状,无隔膜,孢子囊卵圆形或梨形,乳突单生;测得病菌ITS序列为805～877bp,rDNA-ITS序列同源性高,致病菌病原均为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)。     

双重PCR方法检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌

为建立同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法,根据GenBank上公布的洋葱腐烂病菌ITS序列设计1对特异性引物B3/B6,将设计的引物与已发表的检测菊基腐病菌特异性引物ADE1/ADE2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。应用双重PCR体系能从洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌基因组DNA以及人工带菌样品中扩增到特异性条带。结果表明,建立的双重PCR检测方法能同时检测出洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌,可应用于口岸进口郁金香种球2种检疫性细菌的检测。     

基于ITS序列的菟丝子PCR鉴定

提取了7个药用菟丝子种样品的DNA，采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增，并对PCR产物进行克隆和测序．根据所测得菟丝子ITS全长序列与其常见易混品所在属的代表植物ITS序列比对，设计了一对特异性引物并进行了PCR检测．结果表明，此对引物能将药用菟丝子种子与4种易混品区分开来，可以用于药用菟丝子的真伪鉴定．     

福建坛紫菜赤腐病的病程及病原鉴定

于2011年10月-2012年2月,对福建省福鼎市、霞浦县、泉州市和晋江市等海区发生的坛紫菜腐烂病害进行了研究.通过观察发病特征以及镜检,详细记录了该病害的侵染过程,并在发病组织中观察到双鞭毛游动孢子以及孢子囊、雄器和藏卵器等重要结构特征,病菌形态与条斑紫菜上的紫菜腐霉相似;利用半海水玉米琼脂培养基分离提纯该病菌,命名为FM1.经感染试验证实,FM1引起的发病症状与自然海区患病紫菜的症状一致,说明FM1为致病菌.通过扩增该菌核糖体DNA ITS序列,并构建基于ITS+5.8S序列的N-J系统发育树,结果显示FM1菌株与紫菜腐霉的ITS区相似度很高,达到99%.综合形态学及ITS序列分析确定,紫菜腐霉是导致此次病烂的主要病原菌,该病原菌引起的病害称为"赤腐病".     

辽宁地区葡萄白腐病菌遗传多样性分析

为了明确辽宁省不同地区葡萄白腐病菌遗传分化情况,对采自辽宁省沈阳、朝阳、锦州、营口、大连、辽阳等主要葡萄产区的病样进行分离鉴定,对病原菌形态学进行观察及r DNA-ITS序列分析,测得的序列与GenBank中已知序列进行比对,并利用MEGA5.05进行聚类分析。结果表明:分离得到的42株白腐病菌菌落形态基本一致,菌丝平伏,有隔膜,分生孢子器呈球形或扁球形,暗褐色,球内含有大量分生孢子,有孔口;分生孢子单孢,卵圆形,最初无色,后变为暗褐色。病菌rDNA-ITS序列与已知序列的相似度达99%以上,42个菌株的ITS序列同源性极高,不同地区葡萄白腐病菌区域性特征不明显。     

墨兰和蝴蝶兰镰刀菌病害的鉴定

对广东栽培墨兰（Cymbidium sinense （Andr.） Willd.）和蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis Blume）的镰刀菌病害进行了鉴定.经症状观察、病原菌分离培养与回接、病原菌形态观察和内部转录间隔区（Internal transcribed space,ITS）、延伸因子-1α（Elongation factor-1α,EF-1α）序列分析,鉴定出墨兰茎腐病、蝴蝶兰茎基腐病和蝴蝶兰花梗腐烂病等3种镰刀菌病害,其病原菌分别为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄镰刀菌（F.solani）和藤仓镰刀菌（F.Fujikuroi）.其中,蝴蝶兰花梗腐烂病（F.fujikuroi）为兰花上首次报道.     

墨兰和蝴蝶兰镰刀菌病害的鉴定

对广东栽培墨兰(Cymbidium sinense (Andr.) Willd.)和蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis Blume)的镰刀菌病害进行了鉴定.经症状观察、病原菌分离培养与回接、病原菌形态观察和内部转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)、延伸因子-1α(Elongation factor-1α,EF-1α)序列分析,鉴定出墨兰茎腐病、蝴蝶兰茎基腐病和蝴蝶兰花梗腐烂病等3种镰刀菌病害,其病原菌分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄镰刀菌(F.solani)和藤仓镰刀菌(F.Fujikuroi).其中,蝴蝶兰花梗腐烂病(F.fujikuroi)为兰花上首次报道.     

1 株拟盘多毛孢菌的培养·纯化及其ITS区的克隆测序

[目的]为拟盘多毛孢菌分离、纯化及ITS区克隆测序相关研究提供依据。[方法]对鸡枞菌内生拟盘多毛孢菌进行分离、纯化,并通过形态学及分子生物学的方法进行鉴定,对其ITS区进行PCR扩增和克隆测序分析。[结果]形态学鉴定结果显示没有已报道的拟盘多毛孢菌与其相似,系统发育树结果也表明其属于一单独分支中。[结论]建立拟盘多毛孢菌的ITS序列数据库是十分必要的。     

10株镰刀菌rDNA内转录间隔区(ITS)序列分析

[目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组DNA,对其内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增和序列测定。采用Blast方法将测序结果在GenBank中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的ITS序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%~100%。菌株F94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F83和F97与Fusarium incarnatum为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%~100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]ITS序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。     

新疆库尔勒地区3种土壤镰孢菌的形态鉴定和ITS rDNA分析

[目的]镰孢菌是土壤真菌中一类能引起植物和昆虫病害的病原,同时又是可利用的资源.掌握库尔勒地区土壤镰孢菌种类情况,对进一步了解和利用镰孢菌具有深远意义.[方法]运用稀释平板法从土壤中分离到3株镰孢菌,采用形态学及其培养特征进行观察描述,同时利用ITS rDNA序列对其系统发育学进行分析,确定分类地位,并分析比较了基于形态学和ITS rDNA序列分析的两种鉴定手段.[结果]3株菌分别鉴定为芳香镰孢菌(Fusarium redolens)、增殖镰孢菌(Fusarium proliferatum)和木贼镰孢菌(Fusarium equisetic).[结论]与传统方法相比,ITS rDNA方法有着较高的灵敏度.在对镰孢菌的鉴定中,只有将形态学与分子生物学鉴定相结合,才能使镰孢菌的鉴定分类更加完善.     

葛拟锈病菌rDNA-ITS的序列分析

分别从罹拟锈病的野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi、粉葛P.thomsonii Benth.和山葛P.montana(Lour.)Merr.获得病原物拟锈病菌(集壶菌)Synchytrium sp.的孢子囊堆,用其作材料进行了不同DNA提取方法的效果比较,同时对来自以上3种不同植物菌株的核糖体DNA(rDNA)-ITS进行了克隆和序列分析.结果表明:改良的氯化苄法提取基因组DNA的效率最高,但单孢子囊直接进行PCR扩增也可以满足ITS的克隆和分析;来源于野葛和粉葛菌株的ITS1-5.8S-ITS2分别为856 bp和907 bp,两者同源性为92%;而山葛菌株的ITS1-5.8S-ITS2为1 148 bp,与野葛和粉葛菌株的同源性分别为54%和55%.由此推断,粉葛与野葛上的菌株可能为相同种的不同变种,而山葛上的菌株为另一个种;或者3种植物上的菌株分别为3个不同的集壶菌种.     

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA (ribo-somal DNA,rDNA)的ITS( internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性.利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rDNA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段.ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(＞0.60)聚为一类,具有较近的 亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.     

rDNA-ITS2应用于赤眼蜂分子鉴定的研究

本研究通过对拟澳洲赤眼蜂Trichoramma confusum，甘蓝夜蛾赤眼蜂T.brassicae，广赤眼蜂T.evanescens，食胚赤眼蜂T.embryophagum，及松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi的6个地理种群的rDNA-ITS2进行克隆测序，又运用软件DNAStar的MegAlign程序对不同赤眼蜂属间，赤眼蜂属种间，同种不同地理种群之间以及同一赤眼蜂个体不同拷贝之间的ITS2序列的遗传分歧及相似性进行了分析。结果表明：赤眼蜂属与外群ITS2序列的遗传相似性很低，赤眼蜂属内不同种之间IT2序列保守性适中，种内或不同的地理种群之间以及同一个体不同ITS2拷贝间非常保守。说明ITS2序列可作为赤眼蜂种级水平分类鉴定的良好靶标序列。     

适用于rDNA ITS分析的兰属菌根真菌培养及DNA提取方法

为探讨兰属植物与其共生真菌之间专一性关系,采用覆盖纤维素滤膜于PDA培养基的方法培养兰属菌根真菌,提取其DNA后用于rDNA ITS分析。在培养过程中克服PDA液体培养及固体培养获得菌丝体少的缺点,操作方便,获得大量菌丝体;采用改进的提取植物基因组DNA的SDS方法提取真菌的DNA,通过提高缓冲液的pH值、增加EDTA的浓度以提高DNA的提取效果。结果表明,此培养方法及改进的DNA提取方法均简便易行,提取的DNA产量高、质量较好;可满足菌根真菌rDNA ITS分析的要求。     

一株促生拮抗木霉菌的鉴定

从采集的植物根际土壤中分离到一株对黄瓜具有拮抗作用的木霉菌LT19,该菌能够促进黄瓜幼苗的生长,并具有溶磷、产嗜铁素、IAA及ACC脱氨酶的能力,显示了该菌在防治作物病害以及促进作物生长方面潜在的应用价值。根据形态特征与ITS序列分析,将其鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。     

多功能木霉的筛选及鉴定

测定了60株分离自土壤的木霉菌株的解磷解钾、拮抗和对有机磷农药毒死蜱的耐受、降解等功能。结果表明,5株木霉具有很好的解磷能力,其中木霉T-404的解磷效果最好,为109.22 mg·L-1。6株木霉具有明显的解钾透明圈,但是液体培养后测定发现木霉的解钾能力不强。木霉具有不同程度的拮抗作用,其中6株木霉的拮抗能力很好。大部分木霉可以耐受高浓度的毒死蜱,但是不能降解该农药。对5株具多功能潜力的优势木霉菌株进行形态学和分子生物学鉴定表明:T-403、T-404、T-440为Trichoderma koningiopsis,T-400、T-450为Trichoderma koningii。     

河南省栽培平菇品种的种质资源评价

通过拮抗试验,将供试的61个菌株划分为13个营养亲和群,酯酶同工酶电泳显示同一营养亲和群的菌株其同工酶带型一致.而从13个营养亲和群中分别选出1个菌株,酯酶同工酶分析,具有丰富的多态性;ISSR扩增共获得106个位点,多态性位点比例(P)为95.4％;对13个菌株进行ITS扩增,扩增片段测序比对结果表明,13个菌株中1...