猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a - P2.将重组质粒转化BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS - PAGE电...     

新疆南疆地区奶牛乳房链球菌gapC基因原核表达载体的构建

为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5～9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD～66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达

OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。     

猪繁殖候选基因Lhx8的原核表达及条件优化

以猪卵巢组织的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增猪Lhx8基因完整的开发阅读框,将该基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建了原核重组质粒pET28a(+)-Lhx8。将重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现1条特异的蛋白表达条带,分子量为37 kD左右。通过对IPTG浓度和诱导时间的优化,结果显示融合蛋白的最佳诱导浓度为0.4 mmol/L IPTG,最佳诱导时间为37℃诱导12h。     

类人胶原蛋白基因COL6A2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上查到的人胶原蛋白序列COL6A2(NM058175.2),利用Primer 5设计特异性引物,以吉林农业大学生物物理实验室构建的重组质粒pCMV-Sport6-COL6A2为模板进行目的基因的克隆,获得目的基因COL6A2,然后用双酶切的方法连接目的基因COL6A2和表达载体pET32a,将连接产物转化到大肠杆菌中构建原核表达载体pET32a-COL6A2。再将鉴定成功的重组质粒pET32a-COL6A2分别转化到大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(BE3)plysS及Rosetta(DE3)中,采用1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,经12%SDS-PAGE电泳分析并筛选出重组蛋白表达量最高的菌株。利用Ni Sepharose 6 FastFlow琼脂糖树脂亲和层析柱纯化重组蛋白。结果表明:获得了大小为570 bp的COL6A2片段,经测序鉴定序列正确;成功构建了pET32a-COL6A2原核表达载体并表达出约30 kD的目的蛋白;筛选出BL21(DE3)作为高效表达菌株,其重组蛋白表达量占菌体总蛋白的23.9%;经镍离子亲和层析纯化获得了纯度90%的目的蛋白。     

抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coli BLP中的融合表达

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET 28a,将构建的重组质粒pET 28a-Mag转化至E.coliBLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IPTG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。     

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

牛乳铁蛋白素-马盖宁杂合抗菌肽的设计、合成及抑菌活性

根据抗菌肽牛乳铁蛋白素(Lfcin B)与马盖宁(Magainin)的核心功能序列,将Lfcin B(1-15)和Magainin(1-12)二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB15-MA12,采用固相化学合成法合成获得纯度大于95%的LFB15-MA12.微量肉汤稀释法测得LFB15-MA12对金黄色葡萄球菌A...     

牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建

按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列,通过PCR合成BeL1-2-3,经双酶切后克隆入pED质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至E.coliBL-2(1 DE3),获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后,可表达出可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

重组抗菌肽LfcinB/LfampinB基因的克隆及表达载体的构建

根据GeneBank中提供的牛乳铁蛋白基因序列,设计并合成了重组LfcinB/LfampinB基因,并通过PGEM-Teasy载体扩增。酶切回收的LfcinB/LfampinB片段与中间载体pP6连接。pP6上的启动子、信号肽和调控序列与LfcinB/LfampinB共同切下,获得具有上游调控元件的PLfc/Lfa基因片段。将PLfc/Lfa与pME290表达载体连接,并转化绿脓杆菌。结果表明,本试验成功构建了重组pPLfc/Lfa表达载体。     

抗菌肽Lactoferricin B的原核表达及其纯化

牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B,LfcinB)是一种阳离子型抗菌肽,因其具有多种生物学功能,现已被认为具有能够替代传统抗生素的发展前景。然而,由于传统的分离制备方法存在诸多弊端,所以基于基因工程的原核表达技术在制备高纯度和高效表达的该蛋白方面具有极其深远的意义。研究旨在摸索出一套完整的利用原核表达技术制备LfcinB的分子生物学方法。依据大肠杆菌密码子偏爱性的原则,设计了LfcinB的基因序列,通过人工合成的方法获得该基因的优化序列,借助Bam HI和Sal I双酶切、连接等手段将其构建到原核表达载体pGEX-4T-2上,获得重组表达载体pGEX-4T-2-LCB,将该载体转化E.coli Rosetta(DE3)。使用IPTG诱导,结果发现LfcinB在大肠杆菌中表达量超过20%。通过一系列蛋白纯化技术分离得到纯度达到95%以上的LfcinB融合蛋白。抑菌试验结果表明,重组抗菌肽LfcinB融合蛋白具有很好的抑菌活性。研究结果为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。     

杂合抗菌肽Cec Md-CheRc的分子设计及其克隆载体的构建

为了获得具有高抗菌活性和低溶血活性的抗菌肽,利用家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin,设计出杂合抗菌肽Cec Md-Che Rc,并构其克隆载体。选取Cec Md的N端和Chensirin的C端氨基酸序列组成杂合肽,通过互联网和计算机软件,分析比较杂合肽的特征参数并进行结构预测。采用重复序列PCR方法合成2条杂合肽Cec Md-Che Rc I和Cec Md-Che Rc IV的基因,并连接到克隆载体pMD18-T上。分析发现杂合抗菌肽中Cec Md-Che Rc I疏水性最强,Cec Md-Che Rc IV净正电荷数最高;两者N端为疏水性α螺旋结构,C端为亲水性α螺旋结构;两者疏水性氨基酸大体分布在螺旋轮的一侧,其余氨基酸分布在另一侧;带正电荷的氨基酸主要分布在亲水面上。2条杂合肽的基因大小分别为133 bp和124 bp;PCR、双酶切和测序鉴定表明成功地构建了克隆载体pMD18-T/Cec Md-Che Rc I和pMD18-T/Cec Md-Che Rc IV,为后续研究奠定了基础。     

靶基因Bi-1RNAi重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。     

鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。     

牛源整合素β_1亚基的克隆及表达载体的构建

参照已公布整合素β1亚基的基因组序列,设计并合成了对克隆引物,以RT-PCR方法从牛肺组织扩增出约2 400 bp的β1基因,经回收纯化连入PGEM-T载体,测序.依照测序结果设计1对原核表达引物,1对真核表达引物,分别以克隆载体PGEMβ1为模板扩增目的片段,经相应的EcoR I、XhoI和EcoR I、XbaI酶切纯化后,在T4DNA连接酶的作用下,定向亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1zero(+)中,PCR、酶切鉴定及序列测定表明,成功构建了β1亚基原核表达载体pETβ1及真核表达载体pCDNAβ1.     

苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶亚基基因MdCKS表达载体的构建

根据GenBank上与周期蛋白依赖性蛋白激酶基因相关序列,从苹果MdCKS基因编码区设计带有XbaI和SalI酶切位点的引物。以富士MdCKS基因的eDNA为模板将PCR扩增片段连接到pMD18-TSim-pieVector上,测序正确后,再连接到植物表达载体pBII21上,经过抗性筛选和测序验证,成功构建了MdCKS基因表达载体。并通过电击转化法导入农杆菌LBA4404,以备将来用于番茄转化。